苗津東，張丹英，程 雯，俞 瑾，俞超芹

(中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)婦科，上海 200433)

宮頸癌是一種全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率較高的婦科惡性腫瘤，我國每年宮頸癌新發(fā)病例高達(dá)135 000例，占全球的1/3[1]。絕大多數(shù)宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)持續(xù)感染引起，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移是由多因素、多通路共同導(dǎo)致的病理過程[2-3]。其中原癌基因、抑癌基因異常表達(dá)及缺氧是目前宮頸癌研究的熱點(diǎn)。Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP1)是Hippo抑癌通路下游的重要蛋白，參與細(xì)胞生長、DNA修復(fù)等過程[4]。目前發(fā)現(xiàn)，YAP1在卵巢癌[5]、結(jié)直腸癌[6]等惡性腫瘤中呈高表達(dá)，并起到促癌作用。缺氧導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表達(dá)改變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移，這是惡性實(shí)體腫瘤的重要基本特征之一[7]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞低氧反應(yīng)的關(guān)鍵因子，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解以適應(yīng)缺氧微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤微血管形成、生長、轉(zhuǎn)移[8-9]。目前國內(nèi)外關(guān)于YAP1、HIF-1α與宮頸癌臨床特征的相關(guān)性已有研究報(bào)道，但二者對宮頸鱗癌患者預(yù)后的評估價(jià)值尚未明確。本研究以85例宮頸鱗癌患者為研究對象，采用免疫組織化學(xué)法檢測YAP1和HIF-1α的表達(dá)水平，并探討其與患者臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取我院2017年1月～12月收治的85例宮頸鱗癌患者的病灶組織(宮頸癌組)和85例子宮肌瘤患者的正常宮頸組織(對照組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸癌組經(jīng)組織病理學(xué)診斷為宮頸鱗癌，對照組經(jīng)病理學(xué)檢查診斷為正常宮頸組織；②術(shù)前未接受放療、化療、靶向治療或免疫治療；③臨床和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②有宮頸手術(shù)史；③失訪或其他原因死亡。宮頸癌組患者年齡26～79歲，平均(56.36±12.65)歲；對照組患者年齡24～75歲，平均(54.94±14.02)歲，2組患者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核(CHEC2017-128)，所有患者對本研究均知情同意。

1.2 方法

所有組織制成厚度4 μm的石蠟切片。采用免疫組織化學(xué)法檢測組織中YAP1和HIF-1α的表達(dá)情況，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，分別以磷酸鹽緩沖液和已知抗體陽性樣本作為陰性和陽性對照。免疫組織化學(xué)法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人YAP1抗體和鼠抗人HIF-1α抗體均購自美國CST公司。YAP1和HIF-1α均主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，以該部位出現(xiàn)淡黃色至棕褐色為陽性。YAP1和HIF-1α表達(dá)強(qiáng)度以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率判斷。染色強(qiáng)度：無著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)為0分、1分、2分和3分；陽性細(xì)胞率：無陽性細(xì)胞、陽性細(xì)胞率低于10%、陽性細(xì)胞率為11%～50%、陽性細(xì)胞率為51%～75%、陽性細(xì)胞率在75%以上分別計(jì)為0分、1分、2分、3分和4分。以上述兩者乘積作為最后結(jié)果，其中0～3分為低表達(dá)，3分以上為高表達(dá)。所有免疫組織化學(xué)切片和HE染色切片均由2名病理醫(yī)師評定，結(jié)果不一致時(shí)經(jīng)共同商議后確定。

1.3 觀察指標(biāo)

從患者術(shù)后出院之日起每月通過電話、微信等方式對患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間截至2020年12月。記錄所有患者總生存期(overall survival，OS)和無進(jìn)展生存期(progress-free survival，PFS)。OS指從確診為宮頸鱗癌至因腫瘤引起患者死亡或隨訪結(jié)束的時(shí)間；PFS指從患者接受治療至宮頸鱗癌進(jìn)展或患者死亡的時(shí)間。分析患者年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征與YAP1、HIF-1α表達(dá)的關(guān)系，并分析兩種蛋白表達(dá)水平與患者OS和PFS的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織中YAP1和HIF-1α的表達(dá)

宮頸癌組YAP1和HIF-1α的陽性表達(dá)率分別為81.18%和84.71%；對照組中YAP1不表達(dá)，HIF-1α低表達(dá)，陽性表達(dá)率為1.18%。宮頸癌組YAP1和HIF-1α陽性表達(dá)率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。宮頸癌組中42例(49.41%)YAP1高表達(dá)，46例(54.12%)HIF-1α高表達(dá)，高表達(dá)率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 患者YAP1和HIF-1α表達(dá)水平[n=85，例(%)]

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測YAP1和HIF-1α的表達(dá)(×400)

2.2 YAP1和HIF-1α表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

宮頸鱗癌組織中YAP1表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤深度有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。宮頸鱗癌組織中HIF-1α表達(dá)水平與TNM分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤直徑、分化程度無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 YAP1和HIF-1α表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 YAP1和HIF-1α表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

Log-Rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，YAP1和HIF-1α低表達(dá)的患者OS顯著長于高表達(dá)患者(χ2=16.300、6.062，P=0.000、0.014)，YAP1和HIF-1α低表達(dá)的患者PFS顯著長于高表達(dá)患者(χ2=4.655、4.244，P=0.031、0.039)，見表3、4，圖2、3。

表3 YAP1和HIF-1α表達(dá)水平與患者OS的關(guān)系(月)

表4 YAP1和HIF-1α表達(dá)水平與患者PFS的關(guān)系(月)

圖2 不同YAP1和HIF-1α表達(dá)患者OS生存曲線圖

圖3 不同YAP1和HIF-1α表達(dá)患者PFS生存曲線圖

3 討論

宮頸癌已經(jīng)成為影響全球女性生命的重要危險(xiǎn)因素，盡管液基細(xì)胞學(xué)檢測和HPV檢測等宮頸癌篩查技術(shù)已廣泛應(yīng)用，一定程度上做到了宮頸癌“早篩查、早治療”，但我國宮頸癌發(fā)病率和病死率仍居高不下[10]。因此有必要對宮頸癌的發(fā)病機(jī)制、進(jìn)展以及預(yù)后影響因素進(jìn)行深入研究，以探討宮頸癌診斷、預(yù)后評估的新指標(biāo)及治療新靶點(diǎn)，進(jìn)而推動宮頸癌防治的進(jìn)一步發(fā)展。

Hippo信號通路是腫瘤發(fā)生過程中的重要通路，與抑癌基因失活密切相關(guān)[11]。YAP1是一種原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物YAP1在Hippo信號通路中具有中心效應(yīng)作用。正常生理?xiàng)l件下，YAP1處于磷酸化狀態(tài)，其轉(zhuǎn)錄被抑制，細(xì)胞增殖和凋亡處于平衡狀態(tài)。一旦YAP1過度表達(dá)、活性增加，則可激活Hippo信號通路下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[12-13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，YAP1在結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌[14]等多種實(shí)體腫瘤組織中的表達(dá)水平異常上調(diào)并被活化，活化的YAP1能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制凋亡，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。本研究顯示，宮頸鱗癌組織中YAP1陽性表達(dá)率為81.18%，高表達(dá)率為49.41%，且YAP1表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤深度顯著相關(guān)。王文慧等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中YAP1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但本研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者YAP1陽性表達(dá)率與未轉(zhuǎn)移患者比較無顯著差異，這可能與納入樣本存在差異有關(guān)。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，YAP1低表達(dá)患者的OS和PFS顯著長于YAP1高表達(dá)患者，這可能是由于YAP1表達(dá)上調(diào)后腫瘤分化程度更高、浸潤深度更深，因而患者病情更重、腫瘤病理分期更高，預(yù)后更差。惡性實(shí)體腫瘤的進(jìn)展過程對氧的需求量極高，腫瘤細(xì)胞生長速度超過血管供氧量時(shí)腫瘤病灶極易出現(xiàn)缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)和消耗失衡，缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)在這一過程中發(fā)揮著重要的作用[16]。HIF-1有HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基，HIF-1α發(fā)揮氧調(diào)節(jié)作用，當(dāng)腫瘤組織周圍氧濃度處于正常狀態(tài)時(shí)，HIF-1α和HIF-1β處于游離狀態(tài)，無生物學(xué)活性；一旦出現(xiàn)低氧或缺氧，兩個(gè)亞基結(jié)合為HIF-1，可促進(jìn)腫瘤微血管形成，提高運(yùn)氧量，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移能力[17]。目前已經(jīng)在卵巢癌[18]、胰腺癌[19]等多種實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)HIF-1α高表達(dá)。本研究中，宮頸癌組患者HIF-1α陽性表達(dá)率和高表達(dá)率顯著高于對照組患者，且HIF-1α表達(dá)水平與TNM分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，HIF-1α低表達(dá)患者的OS和PFS顯著長于HIF-1α高表達(dá)患者，說明HIF-1α表達(dá)上調(diào)可能與宮頸鱗癌患者病情較重、預(yù)后不良有關(guān)。因此，HIF-1α和YAP1表達(dá)對于評估患者病情、療效和生存期具有重要意義。

綜上，宮頸鱗癌組織中YAP1和HIF-1α表達(dá)較高，與腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征相關(guān)，YAP1和HIF-1α高表達(dá)可能提示患者OS和PFS較短，預(yù)后不良。但本研究未探討放化療、靶向治療等對YAP1和HIF-1α表達(dá)的影響，也未深入分析血清中YAP1和HIF-1α水平以探討其作為療效及預(yù)后評估指標(biāo)的可能性，因此未來還需要進(jìn)行前瞻性研究和體外研究以確定YAP1和HIF-1α表達(dá)在宮頸癌診斷、預(yù)后評估中的價(jià)值。