吳福平, 吳瑜凡, 崔思宇, 邵景東

1.張家港檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司，張家港 215600； 2.張家港海關(guān)綜合技術(shù)中心，張家港 215600； 3.華東理工大學(xué)分析測(cè)試中心,上海 200237； 4.常州經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)環(huán)境衛(wèi)生管理處,常州 213000

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)是革蘭氏陰性菌，菌體彎曲小逗點(diǎn)狀，微需氧，是目前主要食源性病原菌之一，可引起人及動(dòng)物多種疾病，主要癥狀為腹瀉性腸炎，被認(rèn)為是細(xì)菌性腹瀉的主要原因[1-3]。

目前，空腸彎曲菌鑒定方面主要依據(jù)GB/T 4789.9—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 空腸彎曲菌檢驗(yàn)》的傳統(tǒng)生化來(lái)進(jìn)行，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且對(duì)于深加工食品中由于細(xì)菌受到損傷從而導(dǎo)致檢測(cè)難度加大。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR、16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)、多重PCR法及變形高效液相色譜等方法也越來(lái)越多的應(yīng)用于空腸彎曲菌的檢測(cè)，這些方法對(duì)于空腸彎曲菌的快速鑒定發(fā)揮著重要作用[4-6]。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型快速微生物鑒定技術(shù)。其基本原理是，樣品與基質(zhì)在靶表面形成共晶體薄膜，激光照射，基質(zhì)吸收能量，將能量轉(zhuǎn)移樣品解吸，基質(zhì)和樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，樣品電離，經(jīng)過(guò)飛行時(shí)間檢測(cè)器將質(zhì)荷比(m/z)不同的離子分開(kāi)，形成特異性肽蛋白質(zhì)指紋圖譜。采集圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從而獲得鑒定結(jié)果。目前MALDI-TOF-MS已應(yīng)用于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌等食源性致病菌的快速鑒定，與傳統(tǒng)生化鑒定相比，該技術(shù)具備準(zhǔn)確、快速、高通量、低成本的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，操作簡(jiǎn)便，可部分替代傳統(tǒng)生化鑒定和分子生物鑒別方法，適用于對(duì)病原微生物的快速篩檢。但因設(shè)備成本高，難以在基層實(shí)驗(yàn)室普及，部分微生物數(shù)據(jù)庫(kù)還不夠完整，隨著MALDI-TOF-MS方法的進(jìn)一步普及和數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，上述不足有望得到有效完善[7-13]。本文通過(guò)MALDI-TOF-MS方法對(duì)樣品前處理的選擇、穩(wěn)定性、特異性等方面進(jìn)行研究，確定鑒定空腸彎曲菌的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

1.1.1供試菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株：空腸彎曲菌CampylobacterjejuniNCTC11168，結(jié)腸彎曲菌CampylobactercoliATCC33559,結(jié)腸彎曲菌CampylobactercoliATCC43478，胎兒彎曲菌CampylobacterfetusDSM 5361，烏普薩拉彎曲菌CampylobacterupsaliensisDSM 5365，紅嘴鷗彎曲菌CampylobacterlariATCC 35221，豬腸彎曲菌CampylobacterhyointestinalisATCC 35217。從樣品中檢測(cè)出經(jīng)其他生化鑒定方法確認(rèn)為空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌的野生分離株共28株，其中空腸彎曲菌25株、結(jié)腸彎曲菌3株。

1.1.2培養(yǎng)基與試劑血瓊脂平板，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、BTS標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自德國(guó)Bruker公司；VITEK2鑒定卡(NH),購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；乙腈，無(wú)水乙醇，甲酸，三氟乙酸(TFA)。

1.1.3設(shè)備 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Microflex)，德國(guó)Bruker公司生產(chǎn)。微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備，微需氧培養(yǎng)裝置：提供微需氧條件(5% 氧氣、10% 二氧化碳和85% 氮?dú)?。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌分離與純化 參照GB 4789.9—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 空腸彎曲菌檢驗(yàn)》[14]操作。

1.2.2MALDI-TOF-MS測(cè)定

1.2.2.1溶液配制

溶劑I：按照水∶乙腈∶三氟乙酸為50∶47.5∶2.5(v/v)的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用；BTS標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用50 μL溶劑I溶解BTS標(biāo)準(zhǔn)品。用移液器反復(fù)吹吸溶解BTS粉末，室溫放置5 min，再次溶解，待BTS全部溶解后，瞬時(shí)離心，用200 μL PCR管進(jìn)行分裝，每管5 μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CHCA基質(zhì)溶液的配制：在CHCA粉末中加入溶劑I，使CHCA終濃度為10 mg/mL。振蕩混勻，直至溶液澄清。用1.5 mL離心管進(jìn)行分裝，每管50 μL，用封口膜密封管口，室溫放置備用。放置后，如出現(xiàn)大量沉淀應(yīng)棄用。

1.2.2.2樣品前處理和點(diǎn)樣

采用直接轉(zhuǎn)移法、擴(kuò)展的直接轉(zhuǎn)移法、甲酸提取法對(duì)NCTC 11168空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行樣品前處理，以考察不同處理方法對(duì)鑒定結(jié)果的影響。直接轉(zhuǎn)移法：?jiǎn)尉湓诎悬c(diǎn)上涂布成薄層，覆蓋1 μL CHCA溶液，自然晾干；擴(kuò)展的直接轉(zhuǎn)移法：在直接轉(zhuǎn)移法的基礎(chǔ)上，中間部分增加覆蓋1 μL 70%甲酸溶液并自然晾干；甲酸提取法：取單個(gè)菌落加入300 μL去離子水，振蕩混勻；加入900 μL無(wú)水乙醇，混勻，13 000 r/min離心2 min，棄上清液；再次離心除去上清液，室溫干燥3 min；加入30 μL 70%甲酸溶液，吹吸混勻；加入30 μL純乙腈，吹吸混勻，13 000 r/min離心2 min；取1 μL的上清點(diǎn)樣至靶點(diǎn)，自然晾干，覆蓋1 μL CHCA溶液并自然晾干。

1.2.2.3數(shù)據(jù)采集和結(jié)果判定 用標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)儀器校準(zhǔn)后進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)采集和分析。運(yùn)用FlexControl軟件采集數(shù)據(jù)，獲得樣品的質(zhì)譜圖譜；用BioTyper軟件將采集的樣品圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)匹配度判定結(jié)果，分值在2.300～3.000，表示菌種鑒定的可信度較高，可完全確認(rèn)菌株鑒定結(jié)果；2.000～2.299表示保守的菌屬鑒定或可能的菌種鑒定，可基本確認(rèn)鑒定結(jié)果；1.700～1.999表示可能的菌屬鑒定，菌株鑒定為不確定結(jié)果；0.000～1.699表示鑒定結(jié)果不可信。

1.2.2.4特異性試驗(yàn) 選取在生化和形態(tài)學(xué)與空腸彎曲菌較為相近的近緣株結(jié)腸彎曲菌CampylobactercoliATCC33559,結(jié)腸彎曲菌CampylobactercoliATCC43478，胎兒彎曲菌CampylobacterfetusDSM 5361，烏普薩拉彎曲菌CampylobacterupsaliensisDSM 5365，紅嘴鷗彎曲菌CampylobacterlariATCC 35221，豬腸彎曲菌CampylobacterhyointestinalisATCC 35217，以及分離到的3株結(jié)腸彎曲菌疑似菌株進(jìn)行MALDI-TOF數(shù)據(jù)采集，并在VITEK結(jié)果比對(duì),評(píng)價(jià)MALDI-TOF-MS鑒定的準(zhǔn)確性。

1.2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 通過(guò)對(duì)比空腸彎曲菌NCTC11168同一傳代次數(shù)的不同菌落及不同傳代次數(shù)的鑒定結(jié)果，評(píng)價(jià)MALDI-TOF-MS鑒定的穩(wěn)定性。

1.2.3VITEK2鑒定 VITEK2 compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。

1.2.4分離菌株鑒定 25株樣品分離菌株MALDI-TOF-MS技術(shù)鑒定，與VITEK結(jié)果相比較。

2 結(jié)果

2.1 樣品處理方法選擇結(jié)果三種樣品處理方法下空腸彎曲菌NCTC11168的可信度得分均在2.300以上，說(shuō)明鑒定結(jié)果可靠。與其他兩種樣品處理方法相比，甲酸提取法蛋白指紋圖譜的基線平滑、峰強(qiáng)度高(圖1)，信噪比高，更適用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。不同的樣品處理對(duì)MALDI-TOF-MS的鑒定結(jié)果有一定影響，選擇合適的樣品處理方法是保證MALDI-TOF-MS準(zhǔn)確鑒定的前提。

圖1 三種前處理方法對(duì)空腸彎曲菌NCTC11168處理后的MALDI-TOF-MS峰圖

2.2 特異性MALDI-TOF-MS檢測(cè)空腸彎曲菌及其近緣株的結(jié)果表明，該方法可以準(zhǔn)確區(qū)分空腸彎曲菌和其近緣菌株，無(wú)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果發(fā)生(見(jiàn)表1)。

表1 MALDI-TOF-MS檢測(cè)空腸彎曲菌及其近緣株的結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性由穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，空腸彎曲菌NCTC11168同一傳代次數(shù)的3個(gè)菌落平行樣的可信度得分非常接近，且不同傳代次數(shù)的可信度得分無(wú)顯著性差異。

表2 MALDI-TOF-MS檢測(cè)空腸彎曲菌穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 25株分離菌株鑒定結(jié)果結(jié)果表明：MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果一致，均鑒定為空腸彎曲菌，且MALDI-TOF-MS菌種鑒定的可信度較高(表3)。

表3 25株分離菌株的MALDI-TOF-MS與VITEK鑒定結(jié)果

3 討論

通過(guò)比較不同樣品處理方法對(duì)空腸彎曲菌MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸提取法得到的結(jié)果蛋白峰數(shù)量和高度較另外兩種方法更穩(wěn)定。

本文選取6株與空腸彎曲菌相近且較難區(qū)分的近緣彎曲菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行研究。MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果表明，MALDI-TOF-MS能夠準(zhǔn)確快速的區(qū)分彎曲菌近緣菌株，相較于傳統(tǒng)生化方法在時(shí)效性上均有較大提高。通過(guò)與VITEK生化結(jié)果比對(duì)，兩者結(jié)果高度一致。

空腸彎曲菌NCTC11168同一傳代次數(shù)的3個(gè)菌落平行樣的可信度得分非常接近，且不同傳代次數(shù)的可信度得分無(wú)顯著性差異，說(shuō)明空腸彎曲菌MALDI-TOF-MS鑒定方法的穩(wěn)定性較好，同一代次及不同代次的鑒定結(jié)果具有很好的一致性。

25株樣品分離菌株MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果與VITEK生化結(jié)果一致，均鑒定為空腸彎曲菌，且MALDI-TOF-MS菌種鑒定的可信度較高。說(shuō)明本研究建立的空腸彎曲菌MALDI-TOF-MS鑒定方法準(zhǔn)確度高，可用于空腸彎曲菌快速、準(zhǔn)確的鑒定。

綜上所述，MALDI-TOF-MS方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、高通量、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，方法可用于食品中空腸彎曲菌的快速篩檢，也為其它食源性致病菌快速鑒定方法的建立提供參考，有望發(fā)展成為新的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化方法。