井玉林， 侯芙蓉， 唐 文

(上海應用技術大學香料香精技術與工程學院 上海201418)

鐵皮石斛 （Dendrobium officinale Kimura et Migo）是一種具有很高藥用價值的食用植物[1-2]。作為一種中藥，它在醫(yī)學上表現(xiàn)出多種生物活性，包括治療高血糖、肺病、咽喉炎癥等[3-5]。 多糖是鐵皮石斛主要的活性成分， 受到國內外越來越多的關注，近年來，關于鐵皮石斛多糖（DOP）的研究主要集中在其分離、結構分析和藥理活性作用上[3-10]。DOP 的提取主要采用熱水提取、 超聲波與微波輔助熱水提取以及酶輔助熱水提取等方法， 最高提取率可達到26.49%[6]。結構研究表明，DOP 是一種相對分子質量較高的β-D-葡甘聚糖 （23.7～960 ku）且富含O-乙酰基，甘露糖殘基與葡萄糖殘基的物質的量比為2.38∶1～5.2∶1[7-9]。 研究表明DOP具有抗氧化、降血糖、腸道免疫等多種功能，是鐵皮石斛發(fā)揮生物活性的物質基礎[3-5]。

流變學是對物體流動和形變的研究， 一些植物多糖不僅具有顯著的生物活性， 還具有優(yōu)良的流變學性能，可作為穩(wěn)定劑、增稠劑、膠凝劑和黏合劑等食品添加劑廣泛應用于食品工業(yè)中。 近年來， 從不同來源獲得的食品親水膠體被廣泛用于食品工業(yè)，如涼粉草多糖、苦參多糖等[11-12]。 關于DOP 的提取、 結構分析和藥理作用的研究雖然取得顯著的成果，但是對DOP 溶液特性的研究報道尚不多見，其加工適應性尚不明確。

基于以上研究情況， 本研究通過流變與FTIR 方法重點考察多糖質量濃度、溫度、pH 值及金屬離子種類與濃度對鐵皮石斛多糖流體性質和膠凝性質的影響， 以期為鐵皮石斛多糖這種新的親水膠體資源在食品工業(yè)中的利用提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

新鮮鐵皮石斛由安徽省霍山黑石渡生物科技有限公司提供（安徽省六安市霍山縣），上海應用技術大學生態(tài)學院鑒定為蘭科植物鐵皮石斛4年生的鮮莖。

1.2 試劑

葡聚糖 （5.2，25，50，150，410，670 ku），Sigma Adrich 公司（上海）；其它試劑均為分析純級。

1.3 儀器與設備

ARES-G2 流變儀，美國TA 公司；FE 20 實驗室pH 計， 梅特勒-托利多儀器有限公司；Nicolet iS10 傅里葉紅外光譜儀， 美國Thermo 公司；GPC SYSTEM 200 凝膠色譜儀， 珀金埃爾默儀器有限責任公司。

1.4 方法

1.4.1 鐵皮石斛多糖的提取與純化 根據(jù)參考文獻[7]，稱取鐵皮石斛干莖100 g 粉碎，加入10 倍體積的無水乙醇溶液靜置72 h。過濾除去乙醇，收集脫脂、脫色后的鐵皮石斛殘渣，揮干溶劑，然后加入25 倍體積的去離子水，90 ℃水提2 h，重復提取5 次，提取液濃縮后加入4 倍體積的無水乙醇，于4 ℃冰箱中靜置24 h，離心（4 ℃，5 000 r/min，15 min），收集沉淀。 沉淀用無水乙醇清洗3 次，然后加入去離子水溶解得鐵皮石斛粗多糖溶液。 粗多糖溶液用Sevag 法脫蛋白， 所得多糖溶液層濃縮后醇沉靜置過夜，離心收集沉淀，所得沉淀經(jīng)冷凍干燥后得到鐵皮石斛多糖。

1.4.2 DOP 的化學成分測定 參考文獻[13]的方法，分別用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法和考馬斯亮藍法測定DOP 的總糖含量、糠醛酸含量和蛋白質含量。

1.4.3 DOP 的相對分子質量測定 參考文獻[14]的方法，采用GPC 測定DOP 的分子質量。 測試條件：色譜柱型號UltrahydrogelTMColumn （7.8 mm×300 mm），DOP 質量濃度1 mg/mL， 進樣量為10 μL，流動相為0.05% NaN3，流速為0.6 mL/min，柱溫25 ℃。

1.4.4 質量濃度對DOP 水溶液表觀黏度的影響

用去離子水配制質量濃度分別為5，10，20，40，60 mg/mL DOP 水溶液， 采用MCR301 流變儀，考察多糖質量濃度對DOP 水溶液表觀黏度的影響。測試條件：25 ℃，平行板（50 mm 和1 mm 間隙），剪切速率為0.01～1 000 s-1。

1.4.5 溫度對DOP 水溶液表觀黏度的影響 配制20 mg/mL DOP 水溶液， 采用MCR301 流變儀考察溫度對DOP 水溶液表觀黏度的影響。 測定條件： 測試溫度分別 為5，15，25，35，45，55，65，75℃，將DOP 水溶液在水浴中于設定溫度下平衡30 min，剪切速率為0.01～1 000 s-1。

1.4.6 金屬離子對DOP 水溶液表觀黏度的影響

配制20 mg/mL DOP 水溶液， 分別加入KCl、NaCl、CaCl2和AlCl3，使得溶液中金屬離子的最終濃度分別為0.01，0.05，0.1，0.5 mol/L。 測定條件與1.4.4 節(jié)相同。

1.4.7 體系pH 值對DOP 溶液表觀黏度的影響用4 mol/L NaOH 和HCl 調節(jié)質量濃度為20 mg/mL DOP 水溶液的pH 值分別為2.0，4.0，6.0，6.8，8.0，10.0。 測定條件與1.4.4 節(jié)相同。

1.4.8 DOP 的頻率掃描試驗配制10，20，40 mg/mL DOP 水溶液，采用MCR301 流變儀，在應變?yōu)?%條件下，分別測定其儲能模量（G'）與損耗模量（G"）在不同剪切頻率下的變化。測試條件：溫度25 ℃，平行板（50 mm 和1 mm 間隙），頻率范圍為（0～100 Hz）。

1.4.9 DOP 凝膠的FT-IR 分析 將1.4.7 節(jié)中的樣品進行凍干， 取凍干后的DOP 與DOP 凝膠樣品，與適量的KBr 粉末壓片，采用Nicolet iS10 傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1頻率范圍內進行光譜掃描。

2 結果與分析

2.1 DOP 的化學成分與相對分子質量分布

DOP 的化學成分與相對分子質量分布如表1所示。 經(jīng)Sevag 法脫蛋白后所得的DOP，蛋白質含量較低（0.68%），主要由糖（89.38%）和糠醛酸（2.19%）組成，試驗結果與He 等[6]的結果相似。 由圖1 與表1 可知，DOP 由2 種不同相對分子質量的多糖組成，分別為435 526 和64 713，Wang 等[15]認為鐵皮石斛中內源性甘露聚糖酶可能會導致多糖鏈的水解，是DOP 出現(xiàn)多種相對分子質量的可能原因。

圖1 DOP 的GPC 色譜圖Fig.1 GPC profiles of DOP

表1 DOP 的化學成分與相對分子質量Table 1 Chemical composition and molecular weights of DOP

2.2 質量濃度對DOP 水溶液表觀黏度的影響

由圖2 可知， 在1 s-1剪切速率條件下，5 mg/mL 的DOP 水溶液的表觀黏度為0.019 Pa·s，當DOP 水溶液質量濃度增加到10，20，40，60 mg/mL時， 黏度分別增加為0.38，2.38，16.2，56.47 Pa·s。結果表明：DOP 水溶液的黏度隨著DOP 質量濃度的增大而增加。 這可能是隨著DOP 質量濃度的增加，DOP 分子鏈之間的作用加強，從而形成更加穩(wěn)定的網(wǎng)絡結構或纏卷結構[16-17]。 當剪切速率從0.01 s-1增加到1 000 s-1時，5～60 mg/mL DOP 水溶液黏度分別從62.19，19.02，3.18，0.64，0.021 Pa·s 降低為7.51，3.32，0.41，0.15，0.014 Pa·s，表現(xiàn)出剪切稀釋的流動現(xiàn)象， 這是假塑性流體的典型特征， 通常在聚合物分子質量較高的溶液中出現(xiàn)[18-19]高質量濃度（10～60 mg/mL）的DOP 水溶液的表觀黏度隨著剪切速率的增加而明顯地下降，低質量濃度（5 mg/mL）的DOP 水溶液的表觀黏度較低（0.021 Pa·s），且隨著剪切速率增加，多糖的表觀黏度無顯著變化， 表明此質量濃度下多糖呈現(xiàn)牛頓流體流動特性。 Adeli 等[20]認為水溶性多糖的剪切稀釋行為是取向效應的結果， 隨著剪切速率的增加， 無序的多糖分子在流動方向上趨于一致，導致相鄰多糖鏈之間的相互作用減少，溶液黏度降低。

圖2 質量濃度對DOP 水溶液表觀黏度的影響Fig.2 Effects of mass concentration on the apparent viscosity of DOP aqueous solution

對于假塑性流體， 表觀黏度η 與剪切速率γ之間的關系可以用Power-law 模型η=k（γ）n-1進行擬合。 由表2 可知，不同質量濃度的DOP 水溶液擬合系數(shù)R2＞0.99，這說明在25 ℃條件下，質量濃度為5～60 mg/mL DOP 水溶液均服從Power-law模型。 所有樣品的n 值小于1，表明在剪切速率范圍內 （0.01～1 000 s-1），5 種質量濃度的DOP 水溶液均為非牛頓假塑性流體[21]。 當DOP 水溶液質量濃度為5 mg/mL 時，n=0.96317±0.00199，其流動行為接近于理想狀態(tài)的牛頓流體， 隨著質量濃度的增加，DOP 溶液的流變特性指數(shù)逐漸減小，牛頓性流體行為減弱，當DOP 溶液質量濃度為60 mg/mL時，n=0.66263±0.00182， 溶液呈現(xiàn)很好的假塑性。隨著DOP 水溶液的質量濃度從5 mg/mL 增加到60 mg/mL，DOP 水溶液的k 值從0.01827 Pa·s 迅速增加到77.1296 Pa·s，這是由于在高質量濃度的多糖溶液中， 多糖分子可以形成更加致密的網(wǎng)絡結構，使得體系所需克服的應力增大，稠度系數(shù)也相應增大[22]。

表2 DOP 水溶液Power-law 方程擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of Power-law equation for DOP aqueous solution

圖2 及表2 結果表明DOP 水溶液為非牛頓假塑性流體，與已報道的涼粉草多糖、苦參多糖等[11-12]流變行為相似。多糖因為其特殊的結構和延展構象，大多表現(xiàn)出剪切稀釋現(xiàn)象，然而也有一些多糖表現(xiàn)出剪切增稠行為。 Shao 等[23]在裂片石莼多糖的流變特性的研究中發(fā)現(xiàn)其具有獨特的剪切增稠現(xiàn)象， 多糖在不同剪切速率下所表現(xiàn)的流動行為可能其結構和構象的變化有關。

2.3 溫度對DOP 水溶液表觀黏度的影響

由圖3 可知，在5～75 ℃范圍內，質量濃度為20 mg/mL 的DOP 水溶液的黏度變化表現(xiàn)為：隨著體系溫度的升高，DOP 水溶液的表觀黏度逐漸降低。在1 s-1剪切速率下，5 ℃時DOP 水溶液的表觀黏度為4.21 Pa·s， 當溫度升高到15，25，35，45，55，65，75 ℃時， 黏度分別變化為3.11，2.28，1.80，1.71，1.49，1.46，1.29 Pa·s， 表明DOP 水溶液的黏度下降趨勢隨著溫度的上升而逐漸趨緩， 當溫度大于45 ℃時，溶液表觀黏度趨于穩(wěn)定，這一現(xiàn)象與溫度對鼠尾草多糖相似和車前草種子多糖的影響相似[24-25]。

圖3 溫度對DOP 水溶液黏度的影響Fig.3 Effects of temperature on the apparent viscosity of DOP aqueous solution

這種流變行為可能的原因是在較低的溫度下， 多糖能維持其本身網(wǎng)絡結構。 隨著溫度的升高，一些分子間結合力，如氫鍵、疏水鍵會被破壞，導致多糖溶液黏度降低[26]。 從熱力學角度看，溫度升高促進了溶液體系的熱膨脹， 分子的熱運動加劇， 水/溶質-溶質的相互作用因分子間作用力的減小而減弱，從而導致多糖分子間距離的增加，溶液黏度下降；另一方面，根據(jù)Eyring 理論，多糖的流動行為實際上是分子鏈連續(xù)進入流體結構的空間，在此過程中，在較高溫度的保證下，多糖分子可以自由移動，從而減少相互作用，降低了多糖黏度[24，27]。因此，多糖溶液黏度對溫度的依賴性，可能是由于多糖大分子的構象變化， 或是從一個分子平衡過渡到另一個不太穩(wěn)定并伴有熱膨脹現(xiàn)象的分子平衡所致[28]。

2.4 金屬離子對DOP 水溶液表觀黏度的影響

由圖4 可知，金屬離子對DOP 水溶液黏度的影響表現(xiàn)為：DOP 水溶液的表觀黏度隨著Na+濃度的增大而增加，可能是Na+的加入減少了多糖分子的電荷，促使了可溶性分子配合物的產(chǎn)生，從而導致黏度增加；添加K+、Ca2+、Al3+導致DOP 水溶液黏度下降，推測K+、Ca2+、Al3+的添加導致了多糖分子的緊密構象， 改變了多糖大分子的流體力學尺寸，從而引起多糖溶液黏度降低[29]。

圖4 金屬離子對DOP 水溶液表觀黏度的影響Fig.4 Effects of metal ions on the apparent viscosity of DOP aqueous solution

在剪切速率為1 s-1的條件下，20 mg/mL 的DOP 水溶液表觀黏度為1.71 Pa·s， 當分別添加Na+、K+、Ca2+、Al3+至DOP 水溶液中金屬離子濃度為0.5 mol/L 時， 溶液的黏度分別變?yōu)?.42，1.23，1.66，1.84 Pa·s。 結果表明：在等離子濃度下，DOP鹽溶液的黏度大小順序為：Na+>Al3+>Ca2+>K+。 DOP的黏度不僅與特定離子種類有關， 還與離子的價態(tài)成正比（Na+除外），價態(tài)越高，黏度保持率越高。這一現(xiàn)象與Xu 等[30]在研究無機陽離子價態(tài)對結冷膠的黏度影響結果相似，Xu 等認為多糖分子與多價金屬離子之間可能發(fā)生較弱的絡合反應，這種相互作用只能部分抵消靜電屏蔽造成的黏度損失。Na+與K+對黏度影響的趨勢不同這一特性與已報道的突尼斯褐藻多糖的流動行為相似，Hentati等[28]在研究一價陽離子對突尼斯褐藻多糖的流變行為中發(fā)現(xiàn)，Na+比K+使多糖具有更堅硬的內部結構，這是由于在Na+的存在下，多糖分子間相互作用的顯著增加，有助于改善多糖螺旋線圈的尺寸，然而在K+存在下，這些現(xiàn)象則會減少。

與鈉、 鉀離子對DOP 溶液黏度影響相反的是，在結冷膠中，K+的添加使結冷膠的黏度顯著增加，而Na+的添加使結冷膠的黏度顯著降低。 對于這一現(xiàn)象，Xu 等[30]分析表明，K+的存在導致多糖的聚集增強， 多糖的構象轉變伴隨著一些網(wǎng)絡的形成，形成弱凝膠。 這可以用K+與結冷膠的相容性來解釋， K+的水動力半徑與多糖螺旋線形成的空穴結構相似，以及K+沿螺旋線的有序排列，加強了多糖的網(wǎng)絡結構。 對于DOP 溶液中Na+加入引起的黏度增加行為， 是由于鹽的誘導絡合作用或者鹽誘導的競爭水合作用的影響還有待進一步研究。

2.5 pH 值對DOP 水溶液表觀黏度的影響

如圖5 所示。 在1 s-1剪切速率下，20 mg/mL的DOP 水溶液在pH 為2.0 時的的表觀黏度為0.83 Pa·s，當pH 升高到4.0，6.0，6.8，8.0，10.0 時，黏度分別增加到1.32，1.86，2.28，5.98，12.75 Pa·s。結果表明：DOP 水溶液的黏度隨著pH 值的升高，不斷上升， 且溶液在堿性條件下的黏度增長趨勢較酸性條件下變化明顯。Valeria 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，pH值會影響高聚物的的電荷密度和排列方式， 使溶液黏度發(fā)生變化，在酸性條件下，多糖分子間的氫鍵被破壞，多糖分子的網(wǎng)絡結構崩塌，從而降低了其黏度。DOP 溶液的黏度在pH 6.84～10.0 范圍內的變化可能是因為DOP 是一種富含乙?；亩嗵牵?在堿性條件下乙?；l(fā)生水解， 促進了DOP分子間氫鍵的形成，導致溶液黏度增加。

圖5 pH 值對DOP 溶液表觀黏度的影響Fig.5 Effects of pH value on the apparent viscosity of DOP solution

當溶液的pH≥10.0 時，20 mg/mL 的DOP 水溶液靜置后形成凝膠。 由圖6 可知，在20 mg/mL的DOP 水溶液中， 隨著溶液中NaOH 或KOH 的質量濃度從3 mg/mL 增加到12 mg/mL，DOP 水溶液的膠凝時間分別從63 min 和69 min 變?yōu)?9 min 和45 min。當多糖水溶液中NaOH 或KOH 的質量濃度為9 mg/mL 時，隨著溶液中DOP 的質量濃度從20 mg/ml 增加到40 mg/mL，溶液的膠凝時間分別從44 min 和51 min 變?yōu)?7 min 和48 min。 結果表明，DOP 水溶液的膠凝速度與強堿添加量和多糖溶液的質量濃度有關， 同等質量濃度的DOP 溶液， 添加NaOH 比KOH 出現(xiàn)膠凝的速度更快，這一現(xiàn)象可能與2.4 節(jié)中Na+與K+的作用有關。相比較，在pH 2～6.8 范圍內，DOP 溶液的黏度變化趨勢較小，說明DOP 溶液在酸性條件下有較好的穩(wěn)定性。

圖6 強堿種類對DOP 溶液膠凝化時間的影響Fig.6 Effects of alkalis on gelation time of DOP solution

2.6 DOP 的頻率掃描結果

多糖溶液的黏彈性可以通過儲能模量（G'）和損耗模量（G"）體現(xiàn)，損耗角正切（tanδ）是G"與G'的比值， 當tanδ＜1 時主要表現(xiàn)為固體彈性特征；tanδ=1 時，G"曲線與G′ 曲線相交，交點處的頻率稱為交叉頻率， 通常被定義為彈性行為或凝膠狀態(tài)的開始； 而tanδ＞1 則主要表現(xiàn)為液體黏性特征[32]。

通過應變掃描測定了DOP 水溶液的線性黏彈性區(qū)，由圖7 可知，3 種質量濃度的DOP 溶液儲能模量（G′）和損耗模量（G"）在小于1%應變下均保持恒定。 為確保動態(tài)振蕩剪切測量時DOP 結構不被破壞，測量在1%應變下進行。

圖7 DOP 溶液的應變掃描Fig.7 The strain sweeps of DOP solutions

圖8 為3 種質量濃度的DOP 水溶液在應變?yōu)?%的頻率掃描試驗圖譜。 結果表明，在頻率掃描范圍內（0～100 Hz），DOP 水溶液的G"與G′ 均隨頻率增加而增加， 表現(xiàn)出對頻率的依賴性，可能是高頻率促進了分子之間臨時網(wǎng)絡結構的形成。 黏彈性行為似乎與質量濃度有關，表現(xiàn)為隨著DOP 質量濃度的增加，G"與G′ 曲線的交叉頻率逐漸降低（10 mg/mL，398.1 Hz；20 mg/mL，199.5 Hz；40 mg/mL，79.43 Hz）。 苦參多糖[11]、西藏靈菇發(fā)酵乳胞外多糖[18]和涼粉草多糖[12]的流變特性也有相似的結果。

圖8 鐵皮石斛多糖溶液的儲能模量（G′）與損耗模量（G"）隨頻率變化規(guī)律Fig.8 Frequency dependence of storage （G'）and loss （G"） modulus of DOP solution

2.7 DOP 凝膠的FT-IR 分析

pH 值對DOP 的凝膠影響的紅外圖譜如圖9所示。 2 935 cm-1和2 881 cm-1處的吸收峰屬于甲基和亞甲基C-H 鍵吸收峰[33]。1 735 cm-1吸收峰屬于屬于乙?；螋人狨ブ蠧=O 振動[6]。866 cm-1左右的吸收峰表明DOP 由β-D-甘露糖組成[8]。 由圖9 可知， 與pH 4.0 和PH 6.8 的DOP 樣品相比，DOP 凝膠在1 735，2 935 cm-1和2 881 cm-1處的吸收峰發(fā)生了明顯變化，DOP 凝膠化現(xiàn)象可能與堿性條件下乙?；乃饧胺怯H水基甲基與亞甲基的吸收峰變化有關。

圖9 DOP 與DOP 凝膠的紅外光譜圖Fig.9 FT-IR spectra of DOP and DOP gel

3 結論

本研究表明，DOP 是一種相對分子質量分布為435 526 和64 713 的親水性膠體。 DOP 水溶液在不同DOP 質量濃度、溫度、金屬離子和溶液酸堿度條件下表現(xiàn)為假塑性流體， 其流變特性符合Power-law 模型。金屬離子對多糖的黏度有顯著影響， 多糖溶液黏度的變化趨勢與陽離子的價態(tài)相關，表現(xiàn)為價態(tài)越高（Na+除外），黏度越高。DOP 在堿性條件下黏度會發(fā)生顯著變化，當pH>10.0 時，DOP 溶液形成真正的凝膠。 紅外結果顯示，DOP的膠凝現(xiàn)象可能與堿性條件下乙?；乃饧胺怯H水基甲基與亞甲基的吸收峰變化有關，另外，更準確的DOP 膠凝機理正在探究中。DOP 獨特的流體性質與凝膠性質表明， 其在食品水膠體工業(yè)研究中具有潛在價值， 可能成為水溶性凝膠多糖的新來源。