◎ 王麗杰，何麗萍，楊曉暉，張明新

(河南中測技術(shù)檢測服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450000）

志賀氏菌，又稱痢疾桿菌，為革蘭氏陰性桿菌，也是人類細(xì)菌性痢疾最常見的病原菌[1]。它不但可以通過食物和水源傳播、也可通過糞口傳播和接觸傳播，是重要的食源性致病菌之一。據(jù)調(diào)查，全球每年約有1.6億人感染志賀氏菌，大約有110萬人死亡，其中絕大多數(shù)是兒童[2]。在發(fā)達(dá)國家，最常見的是宋內(nèi)氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌[3-4]，志賀氏菌在我國分布廣泛，其中以福氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌最為常見。志賀氏菌能夠污染包括蔬菜、肉類、蛋制品和奶制品在內(nèi)的很多食物，它能分泌內(nèi)、外毒素，以較低的感染劑量使疾病得到有效的傳播，可引起腹痛、腹瀉、里急后重、結(jié)腸水腫和潰瘍等癥狀[5-6]。

目前，志賀氏菌的檢測有傳統(tǒng)的檢測方法，如國家標(biāo)準(zhǔn)法[7]、免疫學(xué)檢測方法等。常規(guī)的國標(biāo)方法檢驗(yàn)志賀氏菌，在增菌和選擇性培養(yǎng)后，再用生化試劑鑒定和血清學(xué)分型，往往需要數(shù)天的時間來得到檢測結(jié)果[8]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，恒溫擴(kuò)增熒光技術(shù)因儀器簡單、操作簡單、使用便捷、特異性高和快速判讀等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微生物檢測中。

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對，按照預(yù)先制訂的準(zhǔn)則評價參加者的能力。當(dāng)有的量值溯源尚難實(shí)現(xiàn)或無法實(shí)現(xiàn)時，可利用能力驗(yàn)證來表明測量結(jié)果的可信性。為監(jiān)督評估本檢測機(jī)構(gòu)人員檢測志賀氏菌屬的能力，提高檢測質(zhì)量，故參加志賀氏菌屬定性檢測的能力驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 樣品和標(biāo)準(zhǔn)菌株

志賀氏菌屬能力驗(yàn)證檢測樣品3個，編號為CFAPA-1192-101、CFAPA-1192-446和CFAPA-1192-068，均為西林瓶真空密封包裝的白色粉狀樣品。標(biāo)記為M1、M2、M3。本次能力驗(yàn)證，由大連中食國實(shí)檢測技術(shù)有限公司組織實(shí)施。福氏志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC（B）51572）作為陽性對照菌株。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

志賀氏菌增菌肉湯、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（NA）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、麥康凱瓊脂（MAC）、三糖鐵瓊脂（TSI）、Kovacs氏靛基質(zhì)試劑盒（Kovacs’s indole kit）、HBI志賀氏菌生化鑒定條、血清和志賀氏菌核酸檢測試劑盒（恒溫?zé)晒夥ǎ?/p>

1.3 儀器與設(shè)備

YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BSC-1500IIA2-X生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物）；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；7L厭氧盒（日本三菱）；Deaou-308C恒溫擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)（廣州迪澳生物科技有限公司）。

1.4 檢測方法

按照國家檢測標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.5—2012檢測步驟對能力驗(yàn)證樣品進(jìn)行檢測，同時用恒溫擴(kuò)增熒光法作為輔助檢測方法，進(jìn)行結(jié)果比對。對篩選出疑似菌落，采用恒溫擴(kuò)增熒光法進(jìn)行鑒定。同時以福氏志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC(B)51572）為陽性對照用菌。

1.4.1 GB 4789.5—2012方法檢測

（1）水化與預(yù)增菌。按照組織單位給定參試指導(dǎo)書再水化能力驗(yàn)證樣品，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.5—2012，將上述檢樣轉(zhuǎn)移至盛有225 mL志賀氏菌增菌肉湯的無菌均質(zhì)袋中，拍打混勻，于41.5 ℃厭氧培養(yǎng)16～20 h。同法操作將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種培養(yǎng)。

（2）分離。各取一環(huán)增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD平板、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板、MAC平板上，于36 ℃培養(yǎng)20～48 h，觀察各平板菌落生長形態(tài)。

（3）初步生化試驗(yàn)。自上述平板上分別挑取3個典型及可疑菌落，分別接種TSI、半固體各一管，由于營養(yǎng)瓊脂無選擇性，可將挑取可疑菌落同時接種至志賀氏菌顯色平板和營養(yǎng)瓊脂平板上，增加選擇效果，置（36±1）℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～24h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。凡是TSI斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)硫化氫、不產(chǎn)氣（福氏志賀氏菌6型可產(chǎn)生少量氣體）及半固體管中無動力的菌株，挑取上述志賀氏菌顯色平皿純培養(yǎng)生長的菌苔，進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)。

1.4.2 恒溫擴(kuò)增熒光法

（1）制備DNA模板。增菌液DNA模板制備方法為取1.4.1中志賀氏增菌液1 mL置于1.5 mL無菌離心管中，12 000 r·min-1離心 2 min，棄上清液，加入 100 μL DNA提取液，混勻后將離心管放置于水浴鍋中，100 ℃加熱5 min，然后12 000 r·min-1離心2 min，取上清液作為DNA模板。單菌落DNA模板制備方法為在無菌PCR管中加入20 μL無菌水，后用無菌槍頭挑取1.4.1中NA平板上純培養(yǎng)的單菌落于PCR管中，用移液槍吹打，重懸混勻，然后置于PCR儀中，執(zhí)行PCR程序95 ℃，10 min，待程序結(jié)束后取出，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液作為反應(yīng)模板。

（2）恒溫擴(kuò)增熒光法反應(yīng)條件。參照志賀氏菌核酸檢測試劑盒（恒溫?zé)晒夥ǎ┑恼f明進(jìn)行，具體操作步驟為在檢測界面分別點(diǎn)擊“請編寫試驗(yàn)名稱”“項(xiàng)目名稱”完成編輯，編輯完后選取“反應(yīng)時間”為45 min；將上述反應(yīng)管放入儀器內(nèi)，點(diǎn)擊“開始檢測”開始反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GB 4789.5—2012檢測結(jié)果

2.1.1 菌落形態(tài)特征

按照GB 4789.5—2012操作，分別取1環(huán)培養(yǎng)后的志賀氏菌增菌肉湯劃線接種于XLD平板、志賀氏菌顯色平板和MAC平板，培養(yǎng)后菌落形態(tài)特征如表1所示。結(jié)果表明，XLD干擾菌的菌落為黃色和無色有黑色中心菌落；MAC干擾菌的菌落為粉色菌落，與典型菌落特征容易區(qū)分；志賀氏菌顯色培養(yǎng)基干擾菌的菌落為綠色、黑色、無色有黑色中心菌落。

表1 選擇性分離平板上的菌落特征表

2.1.2 初步生化鑒定結(jié)果

觀察樣品及標(biāo)準(zhǔn)菌株在XLD、志賀氏菌顯色平板、MAC上的菌落形態(tài)特征，分別挑取3個可疑菌落在TSI斜面劃線后垂直穿刺，因生化鑒定試劑條配置斜面較小，生化現(xiàn)象易被掩蓋，所以TSI最好采用機(jī)構(gòu)自己配置的高層斜面，接種針挑取分離后菌落，于斜面上劃線，再穿刺（穿刺針不要破壁，不要穿透，距底部5 mm左右即可），置于36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～24 h后，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。同時挑取同一菌落劃線于志賀氏顯色平板與營養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行純化，培養(yǎng)后挑取適量菌體，制備成0.5麥?zhǔn)媳葷岬木鷳乙?，用HBI志賀氏菌生化鑒定條進(jìn)行鑒定。樣品M1、M2、M3各挑選3個可疑菌落，標(biāo)準(zhǔn)菌株挑選1個，鑒定結(jié)果見表2。

表2 初步生化實(shí)驗(yàn)、生化鑒定試劑條鑒定結(jié)果表

結(jié) 果 表 明 M1-1、M1-2、M1-3、M3-1、M3-2、M3-3在TSI斜面產(chǎn)酸、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)硫化氫以及產(chǎn)氣，初步判斷為非志賀氏菌屬。M2-1、M2-2、M2-3在TSI斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)硫化氫以及不產(chǎn)氣，初步判斷為可疑志賀氏菌屬。

2.1.3 生化鑒定試劑條鑒定結(jié)果

采用HBI志賀氏菌生化鑒定條對樣品M1、M2、M3的可疑菌落進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2。TSI、半固體初步生化實(shí)驗(yàn)及HBI志賀氏菌生化鑒定條實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品M2中檢出可疑性志賀氏菌屬，M1、M3中未檢出可疑志賀氏菌屬。

2.1.4 血清學(xué)試驗(yàn)

按照GB 4789.5—2012操作，結(jié)果表明M2-1、M2-2、M2-3血清學(xué)凝集，其余血清學(xué)不凝集。根據(jù)2.1.3、2.1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出樣品M2中檢出志賀氏菌，M1、M3未檢出志賀氏菌。

2.2 恒溫擴(kuò)增熒光法鑒定

挑取樣品在不同選擇性平板上的可疑單菌落按照1.4.2進(jìn)行檢測。采用恒溫擴(kuò)增熒光法鑒定，結(jié)果顯示M2以及標(biāo)準(zhǔn)菌株出現(xiàn)對數(shù)增長的S型曲線，表明志賀氏菌屬陽性檢出。M1、M3未出現(xiàn)熒光對數(shù)增長的S型曲線，表明志賀氏菌屬陰性未檢出。

3 結(jié)論

目前，GB 4789.5—2012是被檢測機(jī)構(gòu)經(jīng)常采用的志賀氏菌檢測方法，但根據(jù)志賀氏菌的生長及生化特性，國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法需要經(jīng)過厭氧預(yù)增菌培養(yǎng)、分離純化、TSI半固體生化試驗(yàn)、生化鑒定試劑條或生化鑒定系統(tǒng)鑒定，檢測完成需歷經(jīng)8 d時間，檢測周期較長；而采用恒溫擴(kuò)增熒光法檢測只需提供適宜的恒定溫度，檢測周期僅約20 h，簡單、高效、特異性強(qiáng)、快速且操作簡單。

能力驗(yàn)證樣品M2在XLD及志賀氏顯色培養(yǎng)基上均出現(xiàn)無色帶黑色中心菌落，鑒定為沙門氏菌干擾菌落，如菌落形成較小時，菌落黑色中心未形成，容易誤判為無色菌落，因此，在分離純化時可挑取同一菌落同時分離劃線于志賀氏顯色平板及營養(yǎng)瓊脂平板，在志賀氏顯色平板上判定為純菌落及形態(tài)后，再從營養(yǎng)瓊脂上挑取菌落制備菌懸液。

實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，GB 4789.5—2012中選擇性平板培養(yǎng)基上干擾菌的菌落形態(tài)特征與志賀氏菌的菌落形態(tài)特征相似，不易分辨，如果檢測人員經(jīng)驗(yàn)不足，容易造成漏篩，造成假陰性結(jié)果。另外，菌懸液制備不易把控，影響生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果，易造成假陽性結(jié)果，導(dǎo)致檢測結(jié)果判定錯誤，而恒溫擴(kuò)增熒光法依據(jù)擴(kuò)增曲線走向進(jìn)行檢測結(jié)果的判定，不必選取可疑菌落，避免了漏篩或生化鑒定現(xiàn)象錯判的可能性，提高結(jié)果測定的準(zhǔn)確度和可靠性。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本次檢測機(jī)構(gòu)參加的志賀氏菌屬定性檢測的能力驗(yàn)證結(jié)果為能力驗(yàn)證樣品CFAPA-1192-446檢出志賀氏菌，樣品CFAPA-1192-101、CFAPA-1192-068未檢出志賀氏菌，取得“滿意”結(jié)果，驗(yàn)證了本檢測機(jī)構(gòu)志賀氏菌的檢測能力，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，為政府監(jiān)督部門監(jiān)督執(zhí)法提供強(qiáng)有力技術(shù)支撐。恒溫擴(kuò)增熒光法與GB 4789.5—2012檢測結(jié)果一致。恒溫擴(kuò)增熒光法因儀器簡單、操作簡單、使用便捷、特異性高和快速判讀等特點(diǎn)，可作為志賀氏菌屬檢測驗(yàn)證中的比對方法，兩種方法相互輔助驗(yàn)證，大大提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。