◎ 張樹成，武世敏，鄒振宇，楊進(jìn)潔，趙 收

（1.煙臺(tái)雙塔食品股份有限公司，山東 招遠(yuǎn) 265400；2.招遠(yuǎn)市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 招遠(yuǎn) 265400）

粗纖維是豌豆的主要組成成分之一，根據(jù)品種的不同，豌豆中的粗纖維含量在6.36%～9.43%[1]。研究表明，粗纖維可預(yù)防腸憩室病、心血管病、糖尿病等[2]疾病，能夠提高進(jìn)食后排泄的糞便質(zhì)量，預(yù)防便秘、結(jié)腸癌等[3]，具有改善人體健康狀況的功效[4]。豌豆纖維在人和動(dòng)物的飲食中可以作為一種優(yōu)質(zhì)的纖維補(bǔ)充劑使用[5-6]。廣泛應(yīng)用于面包、面條或其他營(yíng)養(yǎng)食品中，以改善食品膨松性，促進(jìn)人體消化[7]。

除了粗纖維以外，豌豆中還含有52%～55%的淀粉和23%～25%的蛋白質(zhì)。在豌豆粉絲加工過(guò)程中，一部分粗纖維在磨漿、過(guò)濾工序中作為濾渣過(guò)濾出去，還有一部分進(jìn)入淀粉漿中，并在淀粉沉淀過(guò)程中與淀粉分開，和蛋白質(zhì)一起進(jìn)入排放廢水中。為了提高資源利用率，提升效益，將豌豆粉絲廢水進(jìn)一步分離提純，以分離出豌豆纖維。

豌豆粉絲廢水經(jīng)過(guò)第2次和第3次提取，干渣中的蛋白質(zhì)殘留量在5.43%，淀粉含量在63.2%，粗纖維的含量26.6%，灰分4.55%左右?？梢?jiàn)，淀粉是其中的主要成分。另外，蛋白質(zhì)的存在也會(huì)影響纖維的純度，若想獲得純度較高的纖維，必須先將其中的淀粉和蛋白質(zhì)去除。本研究旨在采用α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶多酶分步水解，提高豌豆膳食纖維的純度，為工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆粉絲廢水分離渣原料，由煙臺(tái)雙塔食品股份公司提供。耐高溫α-淀粉酶（活力單位200 000 U·mL-1），無(wú)錫賽德生物工程有限公司；糖化酶（活力單位100 000 U·mL-1），無(wú)錫賽德生物工程有限公司；木瓜蛋白酶（活力單位800 000 U·g-1）、堿性蛋白酶（活力單位200 000 U·g-1）、中性蛋白酶（活力單位200 000 U·g-1）、風(fēng)味酶（活力單位200 000 U·g-1），均為南寧龐博生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

GZX-9097ME型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；JB90-D型強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；FZ102型微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；TD5M型離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；90型恒溫磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠；LY15-9140A型恒溫干燥箱：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；ME204型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

豌豆粉絲廢水分離渣水洗2次，3 000 r·min-1離心5 min后，取沉淀烘干，粉碎，過(guò)60目篩，備用。按照以下步驟進(jìn)行處理：豌豆粉絲廢水分離渣→耐高溫α-淀粉酶水解→糖化酶水解→蛋白酶水解→加熱滅酶→洗滌→離心脫水→熱風(fēng)干燥→粉碎→豌豆膳食纖維粉。

1.3.1 耐高溫α-淀粉酶最佳反應(yīng)參數(shù)的確定

根據(jù)生產(chǎn)工藝需求，將料液比固定在1∶8，調(diào)pH為7.0，對(duì)加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，使用水浴鍋進(jìn)行保溫，試驗(yàn)結(jié)束后取反應(yīng)液與碘液反應(yīng)，以不變藍(lán)為反應(yīng)終點(diǎn)。并根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以提取率為衡量指標(biāo)，獲得耐高溫α-淀粉酶的最佳反應(yīng)參數(shù)。

1.3.2 糖化酶最佳反應(yīng)參數(shù)的確定

根據(jù)生產(chǎn)工藝需求，在耐高溫α-淀粉酶的最佳反應(yīng)參數(shù)下，進(jìn)行糖化酶的添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH的單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程使用水浴鍋進(jìn)行保溫，淀粉經(jīng)兩步水解后分解為還原糖，測(cè)定反應(yīng)后干基還原糖含量即可反映酶解效果。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以反應(yīng)結(jié)束后干基還原糖的含量作為衡量指標(biāo)，確定糖化酶的最佳反應(yīng)參數(shù)。

1.3.3 蛋白酶的種類比較與確定

稱取一定量的原料，使用耐高溫α-淀粉酶和糖化酶處理后，分別加入相同比例的木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味酶，并在該酶最適溫度、pH條件下水解相同的時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)游離氨基酸含量來(lái)確定水解效果最佳的酶。

1.3.4 蛋白酶最佳反應(yīng)參數(shù)的確定

根據(jù)生產(chǎn)工藝需求，將料液比固定在1∶8，通過(guò)蛋白酶的選擇試驗(yàn)以及查找資料，以蛋白酶的加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以反應(yīng)結(jié)束后干基總膳食纖維的含量作為衡量指標(biāo)，確定蛋白酶的最佳反應(yīng)參數(shù)。

1.3.5 檢測(cè)方法及計(jì)算

①膳食纖維提取率的計(jì)算。提取率=處理后的膳食纖維制品干基質(zhì)量/處理前的豌豆粉絲廢水分離渣干基質(zhì)量×100%。②干物質(zhì)含量計(jì)算。干物質(zhì)含量=1-水分含量。③蛋白質(zhì)含量的計(jì)算。參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016）進(jìn)行測(cè)定。④還原糖含量的計(jì)算。參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測(cè)定》（GB 5009.7—2016）進(jìn)行測(cè)定。⑤淀粉含量的計(jì)算。參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測(cè)定》（GB 5009.9—2016）進(jìn)行測(cè)定。⑥水分含量的計(jì)算。參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》（GB 5009.3—2016）進(jìn)行測(cè)定。⑦灰分含量的計(jì)算。參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》（GB 5009.4—2016）進(jìn)行測(cè)定。⑧總膳食纖維含量的計(jì)算。參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測(cè)定》（GB 5009.88—2014）進(jìn)行測(cè)定。⑨氨基酸態(tài)氮的計(jì)算。參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》（GB 5009.235—2016）進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 耐高溫α-淀粉酶正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行耐高溫α-淀粉酶添加量（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）這3個(gè)因素的正交試驗(yàn)，在料液比為1∶8，反應(yīng)pH為7的條件下，采用正交試驗(yàn)來(lái)研究這3個(gè)因素對(duì)豌豆粉絲廢水分離渣的膳食纖維提取率的影響，該試驗(yàn)采用L9(33)正交表，因素水平見(jiàn)表1。

表1 耐高溫α-淀粉酶正交試驗(yàn)各因素及水平設(shè)計(jì)表

1.3.7 糖化酶正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以糖化酶的加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)。耐高溫α-糖化酶因素水平見(jiàn)表2。

表2 糖化酶正交試驗(yàn)各因素及水平設(shè)計(jì)表

1.3.8 蛋白酶正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以堿性蛋白酶的加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表3。

表3 蛋白酶正交試驗(yàn)各因素及水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫α-淀粉酶的最佳反應(yīng)參數(shù)確定

耐高溫α-淀粉酶添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別見(jiàn)表4、表5和表6。

由表4可知，在固定反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的基礎(chǔ)上，通過(guò)反應(yīng)液和碘的變色反應(yīng)可以看出，在加酶量為1.2%時(shí)即可充分完成酶解反應(yīng)，之后隨著酶的添加量增加，反應(yīng)液顏色不變。由表5可知，在固定加酶量和反應(yīng)時(shí)間時(shí)，酶解反應(yīng)在92 ℃時(shí)達(dá)到最佳，溫度過(guò)高或過(guò)低，酶解過(guò)程均效果不佳。由表6可知，在固定加酶量和反應(yīng)溫度時(shí)，60 min即可完成酶解反應(yīng)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，酶解效果無(wú)變化。

表4 耐高溫α-淀粉酶添加量單因素試驗(yàn)結(jié)果表

表5 耐高溫α-淀粉酶反應(yīng)溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果表

表6 耐高溫α-淀粉酶反應(yīng)時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果表

2.2 耐高溫α-淀粉酶正交試驗(yàn)結(jié)果

耐高溫α-淀粉酶正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 耐高溫α-淀粉酶正交試驗(yàn)結(jié)果表

從表7可知，各因素對(duì)提取率的影響的主次順序是：加酶量（A）＞反應(yīng)時(shí)間（C）＞反應(yīng)溫度（B）。理論條件下最優(yōu)的酶解條件為A2B2C3，即耐高溫α-淀粉酶添加量1.2%，反應(yīng)溫度為90 ℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min。在此參數(shù)下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到此時(shí)提取率分別為65.8%、66.6%和66.5%，均高于其他試驗(yàn)組。

2.3 糖化酶最佳反應(yīng)參數(shù)確定

糖化酶的不同反應(yīng)參數(shù)（酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH）對(duì)反應(yīng)后干基還原糖含量的影響分別見(jiàn)圖1、圖2、圖3和圖4。由圖1可知，在酶添加量由2.0%提升到4.0%后，還原糖含量有了大幅度提升，當(dāng)酶添加量超過(guò)4.0%以后，還原糖含量趨于穩(wěn)定。由圖2可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，還原糖含量先上升再下降，并且在60 ℃左右還原糖含量達(dá)到了最高值。由圖3可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量穩(wěn)步上升，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在100 min左右時(shí)，還原糖含量達(dá)到峰值，之后趨于穩(wěn)定。由圖4可知，在pH為4.5左右時(shí)，還原糖濃度達(dá)到了最高，pH過(guò)高和過(guò)低，都會(huì)影響還原糖的生成。

2.4 糖化酶正交試驗(yàn)結(jié)果

糖化酶正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 糖化酶正交試驗(yàn)結(jié)果表

由表8中極差分析結(jié)果可以看出，4個(gè)因素的影響主次順序?yàn)椋杭用噶浚ˋ）＞反應(yīng)時(shí)間（C）＞pH（D）＞反應(yīng)溫度（B）。最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C3D3，即糖化酶加酶量為4.5%，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為110 min，pH為5.0。由于該條件組合在試驗(yàn)中沒(méi)有出現(xiàn)，所以在該條件下做了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，還原糖含量分別為69.3%、69.5%、69.7%，確實(shí)高于表中其他試驗(yàn)組的還原糖含量。

2.5 蛋白酶種類的比較與確定

稱取一定量的原料，使用耐高溫α-淀粉酶和糖化酶處理后，分別加入相同比例的木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味酶，并在該酶最適溫度、pH條件下水解相同的時(shí)間，將物料水洗3次后烘干，通過(guò)檢測(cè)游離氨基酸含量，來(lái)確定效果最佳的酶種類，即游離氨基酸含量越高，酶解效果越好。蛋白酶種類的比較見(jiàn)表9。

表9 蛋白酶種類比較表

由表9可知，在各種蛋白酶的最適條件下，添加同樣比例的酶，堿性蛋白酶組樣品中游離氨基酸含量最高，即堿性蛋白酶的酶解效果最好。

2.6 堿性蛋白酶的最佳參數(shù)確定

堿性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表10。

表10 堿性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果表

由表10中極差分析結(jié)果可以看出，4個(gè)因素的影響主次順序?yàn)閜H（D）＞反應(yīng)時(shí)間（C）＞加酶量（A）＞反應(yīng)溫度（B）。最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C3D2，即加酶量為1.0%，反應(yīng)溫度為55 ℃，反應(yīng)時(shí)間為80 min，pH為8.5。由于該條件組合在試驗(yàn)中沒(méi)有出現(xiàn)，所以在該條件下做了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，膳食纖維含量分別為94.7%、95.0%、94.7%，確實(shí)高于表中其他實(shí)驗(yàn)組的膳食纖維含量。

3 結(jié)論

由于豌豆粉絲廢水分離渣都含有大量的淀粉類物質(zhì)，因此淀粉的去除是提高膳食纖維純度的重要環(huán)節(jié)。在淀粉的去除過(guò)程中，采用耐高溫α-淀粉酶和糖化酶結(jié)合的方式進(jìn)行處理。耐高溫α-淀粉酶使物料中的淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖、糊精等，其特征反應(yīng)就是使底物濃度下降，和碘的特征反應(yīng)減弱直至消失[8]。耐高溫α-淀粉酶添加量1.2%，反應(yīng)溫度為90 ℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min的條件下，豌豆膳食纖維的提取率最高。

使用糖化酶對(duì)豌豆粉絲廢水分離渣中的淀粉以及耐高溫α-淀粉酶的水解產(chǎn)物徹底水解，達(dá)到100%轉(zhuǎn)化為葡萄糖的效果，方便后期通過(guò)水洗的方法將淀粉水解的葡萄糖去除。取糖化酶加酶量為4.5%，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為110 min，pH為5.0，可達(dá)到良好的水解效果。

在去除豌豆粉絲廢水分離渣蛋白質(zhì)的過(guò)程中，選擇了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味酶這4種常用的酶，測(cè)試對(duì)豌豆粉絲廢水分離渣中蛋白質(zhì)的分解結(jié)果。堿性蛋白酶作為工業(yè)使用廣泛的一種酶，比中性蛋白酶的活性更高[9]，且在試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)的分解效果較其他3種酶有明顯優(yōu)勢(shì)。經(jīng)優(yōu)化后，蛋白酶的加酶量為1.0%，反應(yīng)溫度為55 ℃，反應(yīng)時(shí)間為80 min，pH為8.5，此參數(shù)下酶解效果最佳。

研究表明，在耐高溫α-淀粉酶、糖化酶和堿性蛋白酶的多酶分步水解下，豌豆粉絲廢水分離渣的纖維含量可達(dá)到94%以上，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。