陳乾麗，汪漢成，黃 洋，李文紅，蔡劉體，譚清群，陳興江，李 忠

1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng)市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號(hào) 550081

2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽(yáng)市花溪區(qū)甲秀南路 550025

3.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，成都市錦江區(qū)成龍大道一段56號(hào) 610066

4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴陽(yáng)市花溪區(qū)金竹鎮(zhèn) 550006

煙葉霉?fàn)€病（Tobacco pole rot）是煙葉在烘烤期間發(fā)生的一種真菌性病害，具有爆發(fā)性強(qiáng)和危害性大的特點(diǎn)［1］，可引起烘烤期間煙葉嚴(yán)重霉變，造成煙葉產(chǎn)質(zhì)量損失［2-3］，在我國(guó)云南、貴州和福建等煙區(qū)均有發(fā)生和危害［4-7］。該病害由米根霉（Rhizopus oryzae）引起，是一種繁殖速度快、耐熱性強(qiáng)的真菌，可以在適宜環(huán)境條件下攝取煙葉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，破壞煙葉組織［8］。在煙葉烘烤期間，米根霉主要危害葉柄，也可侵染葉片［6-7］。受烤房溫濕度影響，米根霉在不同烘烤階段和烤房部位常表現(xiàn)出不同的侵染能力。米根霉侵染能力與病原菌的致病力及煙葉所處的環(huán)境條件密切相關(guān)［9］。關(guān)于煙葉霉?fàn)€病危害溫度范圍已有一些報(bào)道，Gayed［10］研究發(fā)現(xiàn)，煙葉霉?fàn)€病菌在25~37℃時(shí)生長(zhǎng)繁殖較快，高于40℃時(shí)生長(zhǎng)減緩；陳二龍等［11］試驗(yàn)提出，烤房易發(fā)生煙葉霉?fàn)€病的溫度范圍為32~42℃；蘇家恩等［12］研究認(rèn)為，煙葉霉?fàn)€病終止危害溫度在45℃左右。但有關(guān)溫度、煙葉成熟度、外源創(chuàng)傷對(duì)米根霉致病力的影響尚不明確，病原菌的滲透壓和pH環(huán)境也不清楚。為此，以米根霉為研究對(duì)象，對(duì)其可致病的溫度范圍進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)對(duì)不同成熟度煙葉以及創(chuàng)傷對(duì)其致病力的影響進(jìn)行了檢測(cè)，并應(yīng)用微生物代謝表型技術(shù)（Biolog）分析了不同滲透壓和pH環(huán)境下米根霉的代謝表型，旨在確定影響米根霉致病力的關(guān)鍵溫度范圍及不同滲透壓及pH環(huán)境下病原菌的適應(yīng)能力，為煙葉霉?fàn)€病的有效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株與煙草品種：米根霉菌株Y5（CCTCC M 2015720），由貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室分離獲得，供試煙草品種為云煙87。

供試培養(yǎng)基與試劑：采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15~20 g、蒸餾水1 000 mL）培養(yǎng)米根霉。Biolog PM 9滲透壓代謝板（#12161）、PM 10 pH代謝板（#12162）、接種液FF-IF（#72106），OmniLog PM系統(tǒng)（91171）、濁度測(cè)定儀（3531）、Turbidimeter（3531）及多通道電動(dòng)移液器（3501A），均購(gòu)自美國(guó)Biolog公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同溫度條件下米根霉致病力的測(cè)定

米根霉于PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)48 h，用7 mm打孔器打取菌碟，將菌碟置于煙草離體葉片上，以未接菌培養(yǎng)基為對(duì)照。接菌后將葉片置于不同溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、38℃和45℃）環(huán)境下培養(yǎng)，分別于接菌后24 h和48 h時(shí)觀察葉片發(fā)病情況，測(cè)量病斑直徑，并計(jì)算病斑面積。

1.2.2 米根霉對(duì)葉柄和葉片致病力的測(cè)定

在PDA平板上制備米根霉菌碟（直徑7 mm），將菌碟分別置于煙葉葉柄與葉片上。接菌后的煙葉置于相對(duì)濕度（RH）80%和38℃的環(huán)境下培養(yǎng)，分別于接菌后24 h和48 h時(shí)觀察煙葉葉柄和葉片的發(fā)病情況，并測(cè)量病斑的直徑，計(jì)算病斑面積。

1.2.3 創(chuàng)傷對(duì)米根霉致病力影響的測(cè)定

制備米根霉菌碟（直徑7 mm），將菌碟分別置于有創(chuàng)傷與無(wú)創(chuàng)傷的煙葉上。接菌后將葉片置于RH 80%和38℃的環(huán)境下培養(yǎng)，于接菌后24 h和48 h觀察葉片發(fā)病情況，并測(cè)量病斑直徑，計(jì)算病斑面積。

1.2.4 米根霉對(duì)不同葉位煙葉致病力的測(cè)定

將米根霉菌碟分別置于不同部位的離體葉片（頂葉、上二棚、腰葉、下二棚和腳葉）上。接菌后將葉片置于RH 80%和38℃的環(huán)境下培養(yǎng)，分別于接菌后24 h和48 h觀察葉片發(fā)病情況，并測(cè)量病斑直徑，計(jì)算病斑面積。

1.2.5 不同滲透壓和pH環(huán)境下米根霉代謝特征分析

參照Biolog標(biāo)準(zhǔn)程序［13-15］對(duì)煙葉米根霉的滲透壓和pH環(huán)境下的代謝表型進(jìn)行分析。將供試菌株在PDA平板上25℃培養(yǎng)48 h，直至產(chǎn)生大量孢子。用無(wú)菌水潤(rùn)濕無(wú)菌棉簽，在菌落表面旋轉(zhuǎn)蘸取孢子，將其定容至12 mL的FF-IF接種液中，將孢子懸浮液濃度調(diào)至62%T（T為Biolog標(biāo)準(zhǔn)濃度單位）。吸取600μL孢子懸浮液添加至22.24 mL的PM 9和PM 10接種液中，制備混合接種液，將混合接種液加入PM 9和PM 10代謝板中。將接菌后的代謝板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d。設(shè)置OmniLog工作軟件Biolog D5E_OKA_data.exe，記錄米根霉生長(zhǎng)過(guò)程中代謝板孔內(nèi)的顏色變化值，采用Biolog OL_FM_1.2.exe軟件進(jìn)行顏色值轉(zhuǎn)換，用Biolog OL_PR_1.2.exe軟件分析其代謝特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)米根霉致病力的影響

致病力測(cè)定結(jié)果（圖1）表明，在20℃~45℃測(cè)試溫度范圍內(nèi)，米根霉可致病溫度范圍為20℃~38℃。20℃時(shí)，接菌后48 h時(shí)離體葉片開(kāi)始發(fā)??；25℃~38℃處理，接菌后24 h時(shí)葉片發(fā)?。?8℃時(shí)，病斑擴(kuò)展速度最快。

圖1 溫度對(duì)米根霉致病力的影響Fig.1 Effects of temperature on pathogenicity of Rhizopus oryzae

2.2 米根霉對(duì)葉柄和葉片的致病力

煙草離體葉片的葉柄和葉片組織接種米根霉后均可發(fā)病，接種后24 h時(shí)葉柄和葉片的平均病斑面積分別為4.33 cm2和1.65 cm2，接種后48 h時(shí)葉柄和葉片的平均病斑面積分別為13.5 cm2和3.72 cm2。

2.3 創(chuàng)傷對(duì)米根霉致病力的影響

創(chuàng)傷對(duì)米根霉致病力的影響較大，煙葉存在創(chuàng)傷時(shí)米根霉更容易侵染。接種后24 h時(shí)，創(chuàng)傷和無(wú)創(chuàng)傷煙葉的平均病斑面積分別為5.01 cm2和0.60 cm2，接種后48 h時(shí)的平均病斑面積分別為12.68 cm2和3.31 cm2。

2.4 米根霉對(duì)不同葉位煙葉的致病力

米根霉對(duì)不同葉位煙葉均具有致病力，見(jiàn)表1。葉位自下向上，葉片發(fā)病面積隨葉位的增加而逐漸減小。腳葉的病斑擴(kuò)展速度最快，頂葉的病斑擴(kuò)展速度最慢，可見(jiàn)米根霉對(duì)底部葉片的致病力最強(qiáng)。

表1 米根霉對(duì)不同葉位煙葉致病力的影響①Tab.1 Effects of stalk position on pathogenicity of Rhizopus oryzae to tobacco leaves

2.5 不同滲透壓和p H環(huán)境下米根霉的代謝特征

米根霉在Biolog PM 9和PM 10代謝板上的滲透壓和pH環(huán)境下的代謝表型特征見(jiàn)圖2。米根霉具有廣泛的滲透壓和pH環(huán)境適應(yīng)能力，能在83種滲透壓環(huán)境下生長(zhǎng)，包括1%~10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉、3%~6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鉀、2%~5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）硫酸鈉、5%~20%（體積分?jǐn)?shù)）乙二醇、1%~2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甲酸鈉、2%~3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）尿素、1%~12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乳酸鈉、20~200 mmol·L-1的磷酸鈉（pH 7）、10~100 mmol·L-1的硫酸銨（pH 8）、10~100 mmol·L-1的硝酸鈉、10~100 mmol·L-1的亞硝酸鈉，6%氯化鈉及6%氯化鈉與甜菜堿、氯化鉀、肌氨酸、二甲基磺?；猁}、丙磺酸、四氫嘧啶、膽堿、磷酸膽堿、肌酸、肌酐、左旋肉堿分別共存的滲透壓環(huán)境中生長(zhǎng)；不能在3%~6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甲酸鈉、4%~7%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）尿素及20~200 mmol·L-1苯甲酸鈉（pH 5.2）的環(huán)境中生長(zhǎng)，見(jiàn)表2。

表2 （續(xù)）

圖2 米根霉在Biolog PM 9和PM 10代謝板上的代謝特征Fig.2 Metabolic characteristics of Rhizopus oryzae on Biolog PM 9 and PM 10 microplates

表2 米根霉在不同滲透壓環(huán)境下的代謝表型特征①Tab.2 Metabolic characteristics of Rhizopus oryzae in different osmotic environments

米根霉能在86種pH環(huán)境下正常生長(zhǎng)，包括pH環(huán)境3.5~10.0，pH 4.5時(shí)能在與L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-谷酰胺等35類(lèi)物質(zhì)分別共存的環(huán)境中生長(zhǎng)，pH 9.5時(shí)能在與L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-谷酰胺、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、鄰氨基苯甲酸、色胺、氧化三甲胺、尿素，及辛酯酶、葡萄糖苷、半乳糖苷、葡糖苷酸、氨基葡糖苷、氨基半乳糖苷、甘露糖苷、磷酸鹽和硫酸鹽等分別共存的環(huán)境中生長(zhǎng)，pH 9.5時(shí)不能在與L-天門(mén)冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯基丙氨酸、L-蘇氨酸分別共存的環(huán)境中生長(zhǎng)，見(jiàn)表3。

表3 （續(xù)）

表3 米根霉在不同pH環(huán)境下的代謝表型特征Tab.3 Metabolic phenotypic characteristics of Rhizopus oryzae under different p Hs

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，煙葉米根霉的最低致病溫度為20℃，最強(qiáng)致病力溫度為38℃，在45℃條件下不能侵染煙葉，這與陳二龍等［11］的研究結(jié)果基本一致。不同溫度條件下米根霉的致病力變化趨勢(shì)與其生長(zhǎng)速率的變化趨勢(shì)相似，病害潛伏期隨溫度升高而縮短，在45℃時(shí)致病力下降，這與溫度對(duì)米根霉菌絲生長(zhǎng)速率的影響一致［10］。

本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)米根霉侵染不同葉位的煙葉時(shí)病斑擴(kuò)展速度存在差異，頂葉病斑擴(kuò)展最慢，腳葉病斑擴(kuò)展最快，上二棚葉、腰葉和下二棚煙葉間無(wú)明顯差異。由于不同葉位煙葉的成熟度不同［16］，推測(cè)米根霉致病力與煙葉成熟度密切相關(guān)，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)米根霉接種后，煙葉葉柄和葉片組織均發(fā)生霉?fàn)€，但煙葉存在創(chuàng)傷時(shí)煙葉霉?fàn)€速度更快，無(wú)創(chuàng)傷時(shí)霉變速度相對(duì)較慢。這與烘烤期間煙葉霉?fàn)€病從葉柄創(chuàng)傷處開(kāi)始發(fā)生，沿著葉基逐漸向葉片主脈、側(cè)脈及葉肉擴(kuò)展的現(xiàn)象一致［17］，推測(cè)葉柄創(chuàng)傷為米根霉侵染創(chuàng)造了有利條件。煙草霉變通常是微生物、環(huán)境和寄主等多因素互作的結(jié)果，其中溫度與濕度是重要的影響因子。本試驗(yàn)中僅測(cè)定了溫度對(duì)米根霉致病力的影響，而有關(guān)米根霉的可致病濕度范圍，以及多種因素交互作用模式下煙葉霉?fàn)€病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。

本研究中，基于Biolog代謝表型技術(shù)測(cè)定了米根霉可生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的pH范圍在3.5~10.0之間，當(dāng)pH為4.5時(shí)，米根霉能代謝大部分被測(cè)試的氨基酸；當(dāng)pH為9.5時(shí)，不能代謝大部分被測(cè)試的氨基酸，表明米根霉具有較強(qiáng)的脫羧酶活性和較弱的脫胺酶活性。這與米根霉在發(fā)酵工程上的應(yīng)用結(jié)果一致［18］。米根霉對(duì)不同滲透壓物質(zhì)表現(xiàn)出不同的代謝活性，反映了米根霉在不同逆境條件下的環(huán)境適應(yīng)力，如≥3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甲酸鈉、≥4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）尿素、≥20 mmol·L-1苯甲酸鈉等均不能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。因此通過(guò)施用不同濃度滲透壓物質(zhì)控制煙葉霉?fàn)€和減輕危害具有潛力，但還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

米根霉的可致病的溫度范圍為20℃~38℃，45℃時(shí)無(wú)致病力；煙葉葉柄創(chuàng)傷有利于病原菌的侵染，米根霉對(duì)煙株下部葉的致病力大于上部葉；米根霉具有廣泛的滲透壓和pH適應(yīng)能力，能在1%~10%氯化鈉、3%~6%氯化鉀、2%~5%硫酸鈉、5%~20%乙二醇等滲透環(huán)境中正常生長(zhǎng)，不能在3%~6%甲酸鈉、4%~7%尿素的滲透環(huán)境中生長(zhǎng)；米根霉適應(yīng)pH范圍為3.5~10.0，最適pH約為7.0；米根霉具有較強(qiáng)的脫羧酶活性和較弱的脫胺酶活性。