張華述，蔣 勛，張瑞娜，廖 瑯，劉國(guó)祥，鄒宇航，王 俊，燕思凡，范靜苑，李曉旭，鐘 秋*，張興偉*

1.四川省煙草公司德陽市公司，四川省德陽市旌陽區(qū)長(zhǎng)江東路176號(hào) 618400

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)4路11號(hào) 266101

3.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司長(zhǎng)城雪茄煙廠，四川省德陽市什邡市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)鎣華山路南段128號(hào) 618499

4.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，長(zhǎng)沙市勞動(dòng)中路386號(hào) 410007

雪茄煙為全煙葉構(gòu)成的圓或方柱形煙支，是一種特殊的煙草制品。近年來，雪茄煙吸引了越來越多的消費(fèi)者，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求日益增長(zhǎng)，產(chǎn)業(yè)前景廣闊［1］。然而，我國(guó)雪茄煙葉研究工作起步晚，基礎(chǔ)研究相對(duì)落后，目前種植的品種絕大部分為國(guó)外品種或地方晾曬煙品種［2-4］。四川是我國(guó)著名的雪茄煙葉種植地，其中國(guó)外引進(jìn)品種德雪1號(hào)、德雪2號(hào)、德雪3號(hào)及地方曬煙什煙一號(hào)在該地區(qū)廣泛栽植。由于該地種植品種較為單一且主栽品種退化，雪茄煙葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到制約［5］。因此，雪茄煙葉種質(zhì)資源的遺傳分析對(duì)四川地區(qū)后期種質(zhì)資源的開發(fā)利用、現(xiàn)有主栽品種的改良及新品種的選育等至關(guān)重要。

僅依靠田間農(nóng)藝性狀進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳分析的工作量大、成本高且準(zhǔn)確性低，而分子標(biāo)記技術(shù)可大大提高遺傳分析的準(zhǔn)確性和效率。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）廣泛分布于真核生物基因組中。SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、檢測(cè)成本低廉及穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。Bindler等［6］構(gòu)建第一張煙草SSR分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜后，SSR分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于烤煙［7］、晾曬煙［8］及香料煙［9］的種質(zhì)資源遺傳分析。此外，基于SSR分子標(biāo)記的雪茄煙葉遺傳分析也有少量研究，王琰琰等［10］通過14個(gè)SSR分子標(biāo)記對(duì)220份雪茄煙葉種質(zhì)進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建；向小華等［11］基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)海南雪茄煙葉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。但目前針對(duì)四川地區(qū)雪茄煙葉種質(zhì)資源的遺傳分析還鮮見報(bào)道。為此，基于農(nóng)藝性狀和SSR分子標(biāo)記對(duì)20份國(guó)內(nèi)外雪茄煙葉著名產(chǎn)地的種質(zhì)資源進(jìn)行了系統(tǒng)遺傳多樣性分析，以期確定四川雪茄煙葉種質(zhì)資源的遺傳背景，為其后續(xù)的鑒定、保存、開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為20份雪茄煙葉種質(zhì)資源，均來自四川省煙草公司德陽市公司，具體信息見表1。參試品種連續(xù)3年（2019—2021）種植于四川省什邡市洛陽村試驗(yàn)田。試驗(yàn)為完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，采用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理方法進(jìn)行田間管理。移栽期為每年4月下旬，設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植1行，每行20株，株行距40 cm×110 cm，施純氮9.5 kg/666.7 m2。

表1 供試雪茄煙葉種質(zhì)資源信息Tab.1 Information of cigar tobacco germplasm resources

1.2 性狀調(diào)查

在各種質(zhì)中心花開放期進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查。農(nóng)藝性狀包括葉長(zhǎng)、葉寬、葉片數(shù)、葉片厚薄、株高、莖圍、節(jié)距、支脈粗細(xì)、主脈粗細(xì)、支脈數(shù)、主側(cè)脈夾角和莖葉夾角。田間性狀調(diào)查按照《煙草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［12］進(jìn)行。

1.3 基因組DNA的提取

取團(tuán)棵期幼嫩葉片置于2 mL離心管（山東思科捷生物技術(shù)公司）中并快速放入液氮中冷凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后利用SLS法提取DNA［10］，加ddH2O在4℃條件下溶解12 h。將DNA濃度統(tǒng)一稀釋到50 ng/μL，-20℃低溫保存。

1.4 SSR引物

利用6個(gè)雪茄煙葉品種（Little Dutch、H211、Beinhart1000-1、Hicks、Havana10、H382）對(duì)Bingler等［6］公布的2 317對(duì)SSR引物進(jìn)行初步篩選（圖1），最終獲得43對(duì)多態(tài)性好、條帶清晰的引物（表6），由六合華大（北京）基因科技有限公司合成。

圖1 SSR引物（部分）的篩選Fig.1 Screening of SSR primers（Partial）

1.5 PCR擴(kuò)增

使用PCR儀（LS-TP96，美國(guó)LabSERV公司）對(duì)提取的樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為10μL（DNA 1μL，2×Taq Master Mix 5μL，ddH2O 2μL，上、下游引物各1μL）。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 農(nóng)藝性狀

使用Microsoft Excel計(jì)算各數(shù)量性狀的最小值、最大值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)和多樣性指數(shù)。遺傳多樣性指數(shù)計(jì)算采用Shannon Wiener信息指數(shù)，計(jì)算公式：H′=-∑Piln Pi（i=1，2，…，n）。式中：Pi為某性狀第i個(gè)級(jí)別出現(xiàn)的概率［13］。利用Origin 9.1進(jìn)行主成分分析和聚類分析［14］。將調(diào)查數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換，聚類方法采用組內(nèi)連接法，以歐氏距離繪制聚類樹狀圖。

1.6.2 SSR標(biāo)記

用DataFormater軟件將讀取的“0、1”數(shù)據(jù)進(jìn)行矩陣轉(zhuǎn)換；用MEGA 7.0.21軟件進(jìn)行聚類分析，采用非加權(quán)組平均法（Unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）；利 用NTSYS-pc 2.10軟件進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）；利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪茄煙葉種質(zhì)資源的表型鑒定及遺傳多樣性分析

2.1.1 雪茄煙葉種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀的多樣性分析

不同年份20份雪茄煙葉種質(zhì)資源12個(gè)農(nóng)藝性狀的表型數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差無顯著差異，表型數(shù)據(jù)的環(huán)境誤差較低（表2）。各農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)在6.59%~19.97%之間，遺傳多樣性指數(shù)在1.69～2.18之間（表3）。表型的平均變異系數(shù)為10.10，其中葉數(shù)的變異系數(shù)最高，達(dá)19.97%；其次為株高，為13.70%。支脈數(shù)的變異系數(shù)最低，為6.59%；其次是主側(cè)脈夾角，為6.74%。表型的平均遺傳多樣性指數(shù)為2.03，其中株高的遺傳多樣性指數(shù)最高，達(dá)2.18；其次為主脈粗細(xì)，為2.15。葉長(zhǎng)的遺傳多樣性指數(shù)最低，為1.69；其次是莖葉夾角，為1.85。表明參試的雪茄煙葉種質(zhì)資源具有較豐富的表型變異。

表3 雪茄煙葉種質(zhì)資源數(shù)量性狀遺傳多樣性分析Tab.3 Genetic diversity analysis of quantitative traits of cigar tobacco germplasm resources

2.1.2 雪茄煙葉重要農(nóng)藝性狀的主成分分析

利用Origin 9.1對(duì)供試種質(zhì)的12個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分分析（表4），主要信息集中在前5個(gè)主成分中，累計(jì)貢獻(xiàn)率為83.55%。第1主成分的特征值為3.427，貢獻(xiàn)率為28.56%，主要因素是主脈粗細(xì)、支脈粗細(xì)、莖圍、葉長(zhǎng)等煙葉外觀品質(zhì)性狀，其特征向量分別為0.431、0.404、0.367和0.357。第2主成分的特征值為2.596，貢獻(xiàn)率為21.63%，主要因素是葉片厚薄、株高和支脈數(shù)等雪茄煙葉產(chǎn)量和外觀品質(zhì)性狀，其特征向量分別為0.472、0.439和0.422。第3主成分的特征值為2.102，貢獻(xiàn)率為17.51%，主要因素是節(jié)距、葉長(zhǎng)和葉數(shù)等與產(chǎn)量相關(guān)的性狀，其特征向量分別為0.410、0.399和0.367。第4主成分的特征值為1.054，貢獻(xiàn)率為8.78%，主要因素是莖葉夾角，該性狀與株型相關(guān)。第5主成分的特征值為0.848，貢獻(xiàn)率為7.07%，主要因素是主側(cè)脈夾角、葉片厚薄等外觀品質(zhì)性狀。根據(jù)各性狀的特征值和貢獻(xiàn)率的大小，認(rèn)為株高、莖圍、葉長(zhǎng)、莖葉夾角、支脈粗細(xì)、主脈粗細(xì)和支脈數(shù)是造成供試雪茄煙葉種質(zhì)資源表型差異的主要因素，可為今后雪茄煙葉育種中資源鑒定評(píng)價(jià)和親本選擇提供借鑒。

表4 農(nóng)藝性狀的主成分分析Tab.4 Principal component analysis of agronomic traits

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2.1.3 基于農(nóng)藝性狀的雪茄煙葉種質(zhì)資源聚類分析

基于12項(xiàng)農(nóng)藝性狀對(duì)20份雪茄煙葉種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，遺傳距離為30時(shí)，分為4個(gè)類群（圖2）。各類群的農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表5）的結(jié)果表明，各大類群的雪茄煙葉種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀具有顯著差異。第Ⅰ類群包含5份資源，有德雪1號(hào)、德雪2號(hào)、德雪3號(hào)、哈珀納斯和Cubra-Brazil。該類群種質(zhì)的表型特征為：煙株較高，葉數(shù)較多，葉片短薄，主側(cè)脈夾角最小且主脈細(xì)。其中主側(cè)脈夾角變異系數(shù)最低，主脈粗細(xì)和支脈數(shù)的變異系數(shù)較高。第Ⅱ類群包含3份資源，有C-15、多米尼加長(zhǎng)芯和多米尼加短芯。該類群種質(zhì)的表型特征為：煙株高，葉數(shù)多，葉片窄薄，主側(cè)脈夾角較大且支脈數(shù)多。其中株高、莖圍、葉數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬和主脈粗細(xì)的變異系數(shù)較低，主側(cè)脈夾角的變異系數(shù)最高。第Ⅲ類群包含7份資源，有Habana92、OLOR、CP2011、MSCA、MNC、CS0708和3763。該類群種質(zhì)的表型特征為：莖細(xì)，葉數(shù)最少，葉窄長(zhǎng)，主側(cè)脈夾角大，莖葉夾角大且支脈細(xì)。其中節(jié)距的變異系數(shù)最高，支脈粗細(xì)和支脈數(shù)的變異系數(shù)較低。第Ⅳ類群包含5份資源，有什煙一號(hào)、美國(guó)康州闊葉、MFPP、MFZS和尼加拉瓜長(zhǎng)芯。該類群種質(zhì)的煙株較矮，葉數(shù)較少，莖葉夾角小，葉片厚且主支脈粗。其中株高、莖圍、葉數(shù)、葉長(zhǎng)和支脈粗細(xì)的變異系數(shù)較大，葉片厚薄的變異系數(shù)最低。

圖2 基于農(nóng)藝性狀的雪茄煙葉種質(zhì)資源聚類圖Fig.2 Cluster map of cigar tobacco germplasm resources based on agronomic traits

表5 各類群雪茄煙葉種質(zhì)的農(nóng)藝性狀特征Tab.5 Agronomic traits of cigar tobacco germplasm in different groups

2.2 基于SSR的雪茄煙葉種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

2.2.1 主成分分析

43對(duì)SSR引物在20份種質(zhì)資源中共檢測(cè)出247個(gè)基因位點(diǎn)（表6）。同時(shí)，檢測(cè)到等位基因數(shù)為2~13個(gè)，平均5.65個(gè)，其中PT52689的最多，PT52176的最少，具體基因型信息見表6。

表6 SSR分子標(biāo)記信息表Tab.6 Information of SSR markers

主成分分析的二維圖將供試種質(zhì)劃分為3個(gè)類群（圖3），類群Ⅰ包括德雪1號(hào)、多米尼加短芯和C-15等7份種質(zhì)，類群Ⅱ包括CS0708、尼加拉瓜長(zhǎng)芯和OLOR等8份種質(zhì)，類群Ⅲ包括哈伯納斯、美國(guó)康州闊葉、CP2011和MFZS共4份種質(zhì)。另外，中國(guó)四川的德雪1號(hào)、德雪2號(hào)和德雪3號(hào)均屬于類群Ⅰ，而什煙一號(hào)則是離群樣本。

圖3 基于SSR標(biāo)記的雪茄煙葉種質(zhì)資源主成分分析Fig.3 Principal component analysis of cigar tobacco germplasm resources based on SSR markers

2.2.2 聚類分析

UPGMA聚類法可以很好地區(qū)分供試種質(zhì)資源，在遺傳距離為0.3處將20份種質(zhì)聚類成4個(gè)類群（圖4），類群Ⅰ包含德雪1號(hào)、德雪2號(hào)、德雪3號(hào)、C-15和多米尼加長(zhǎng)芯等11份種質(zhì)；類群Ⅱ包含OLOR、CP2011、MFPP、MSCA和MNC共5份種質(zhì)；類群Ⅲ包含3763和MFZS共2份種質(zhì)；類群Ⅳ包含什煙一號(hào)和CS0708共2份種質(zhì)。聚類分析結(jié)果和主成分分析結(jié)果雖存在一定差異，但2次分析中，中國(guó)四川的德雪1號(hào)、德雪2號(hào)和德雪3號(hào)與C-15、多米尼加長(zhǎng)芯和多米尼加短芯均聚類至同一類群，說明它們之間有較高的遺傳相似度。

圖4 基于SSR標(biāo)記的雪茄煙葉種質(zhì)資源聚類分析Fig.4 Cluster analysis of cigar tobacco germplasm resources based on SSR markers

2.2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Structure軟件對(duì)供試的雪茄煙葉種質(zhì)進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，由ΔK（似然值）確定最優(yōu)分群數(shù)K值，當(dāng)K=3時(shí)似然值最大（圖5a），因此將供試種質(zhì)劃分為3個(gè)類群。類群Ⅰ包含MNC、MSCA和MFPP；類群Ⅱ包含多米尼加長(zhǎng)芯、多米尼加短芯、什煙一號(hào)和3763等10份種質(zhì)；類群Ⅲ包含德雪1號(hào)、尼加拉瓜長(zhǎng)芯和C-15等7份種質(zhì)。其中，四川的德雪1號(hào)、德雪2號(hào)和德雪3號(hào)再次與古巴種質(zhì)C-15聚類至同一類群，說明這4個(gè)種質(zhì)具有很高的遺傳相似度。

圖5 基于SSR標(biāo)記的雪茄煙葉種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Genetic structural analysis of cigar tobacco germplasm resources based on SSR markers

3 討論

3.1 基于農(nóng)藝性狀的雪茄煙葉種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

20份雪茄煙葉種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀的遺傳多樣性的分析結(jié)果表明，供試的雪茄煙葉種質(zhì)資源具有豐富的表型多樣性，資源的可利用范圍較大。同時(shí)根據(jù)12個(gè)農(nóng)藝性狀將供試種質(zhì)資源聚類為4大類群。根據(jù)各類群的表型特征，第Ⅰ類群可作為選育高產(chǎn)茄衣品種的候選群體，且德雪1號(hào)、德雪2號(hào)和德雪3號(hào)這3個(gè)品種均分布其中；第Ⅱ類群可作為高產(chǎn)茄芯品種的候選群體；第Ⅲ類群可作為優(yōu)質(zhì)茄衣品種的候選群體；第Ⅳ類群可作為優(yōu)質(zhì)茄芯品種的候選群體。12個(gè)農(nóng)藝性狀的主成分分析結(jié)果表明，前5個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)83.55%。因此，在雪茄煙葉的品種改良和新品種選育時(shí)，需綜合考慮品種農(nóng)藝性狀間的相互關(guān)系［15］。

3.2 基于SSR標(biāo)記的雪茄煙葉種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

20份雪茄煙葉種質(zhì)資源的主成分分析、聚類分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果存在一定差異，主成分分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析將供試種質(zhì)分為3大類群，聚類分析把供試種質(zhì)分為4大類群。主成分分析的類群Ⅰ和類群Ⅱ包含于聚類分析的類群Ⅰ中，遺傳結(jié)構(gòu)分析的類群Ⅰ包含于聚類分析的類群Ⅱ中。該差異可能是因?yàn)楣┰嚾后w較小，并且各種聚類方法的依據(jù)不同［16］（主成分分析基于遺傳相似度系數(shù)，聚類分析基于遺傳距離，遺傳群體結(jié)構(gòu)分析則基于等位基因頻率差異），從而導(dǎo)致不同方法得到的結(jié)果存在差異。但3種分析方法的結(jié)果均與地理來源相關(guān)，且四川的德雪1號(hào)、德雪2號(hào)和德雪3號(hào)多次被聚類至同一類群。多米尼加長(zhǎng)芯和多米尼加短芯多次被聚類至在同一類群，這與向小華等［11］的研究結(jié)果一致。同時(shí)，基于SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析結(jié)果和基于農(nóng)藝性狀的聚類分析結(jié)果相似，說明本研究中對(duì)供試種質(zhì)的遺傳多樣性分析較準(zhǔn)確，可為種質(zhì)資源的開發(fā)利用和新品種的選育提供參考。

3.3 四川雪茄煙葉溯源

供試的雪茄煙葉種質(zhì)資源雖僅有20份，但大多來自古巴、美國(guó)、多米尼加等世界著名雪茄煙葉產(chǎn)地，具有很高的地區(qū)代表性和研究潛力。供試雪茄煙葉種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀聚類分析結(jié)果表明，德雪1號(hào)、德雪2號(hào)和德雪3號(hào)這3個(gè)品種在農(nóng)藝性狀上具有很高的遺傳相似度。同時(shí)，基于SSR標(biāo)記的主成分分析、聚類分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果均表明，德雪1號(hào)、德雪2號(hào)和德雪3號(hào)與古巴的C-15屬于同一類群，并與多米尼加長(zhǎng)芯、多米尼加短芯也有較高的遺傳相似度，與王琰琰等［10］的研究結(jié)果基本一致，這也為德雪系列的溯源研究提供重要線索。此外，什煙一號(hào)是具雪茄風(fēng)味的本土?xí)駸熎贩N，于明朝末年自東南亞引入中國(guó)四川什邡［17］。由于長(zhǎng)期的地理隔離，什煙一號(hào)與其他參試種質(zhì)資源的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此什煙一號(hào)在SSR標(biāo)記的主成分分析中成為離群樣本。確定德雪1號(hào)、德雪2號(hào)、德雪3號(hào)和什煙一號(hào)4個(gè)四川雪茄煙葉主栽品種的遺傳背景，可為其品種改良提供參考。

4 結(jié)論

對(duì)四川德陽煙草公司收集的20份雪茄煙葉種質(zhì)資源進(jìn)行的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，供試種質(zhì)農(nóng)藝性狀的平均遺傳多樣性指數(shù)為2.03，平均變異系數(shù)為10.10，表型變異豐富?；谵r(nóng)藝性狀的群體結(jié)構(gòu)分析和基于SSR標(biāo)記的群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果基本一致，且分析結(jié)果均與地理來源相關(guān)。確定了四川雪茄煙葉種質(zhì)資源的遺傳背景，德雪1號(hào)、德雪2號(hào)和德雪3號(hào)與古巴品種C-15有較高的親緣關(guān)系，為其主栽品種改良和新品種選育提供了較好的理論基礎(chǔ)。