袁海霞，關(guān)佩珊，金赟杰，楊 萍，吳愛琴，王文平，3*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院超聲科，廈門 361015

2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院超聲科，上海 200032

3. 復(fù)旦大學(xué)超聲醫(yī)學(xué)與工程研究所，上海 200032

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 是一種富血管實(shí)體瘤，發(fā)病率居全球惡性腫瘤第5位，相關(guān)死亡率居第3位［1］。近年來，納米級(jí)微泡超聲造影劑在HCC診療中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。納米級(jí)微泡進(jìn)入機(jī)體后可逃脫機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除，在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長，并可穿透腫瘤血管屏障，通過滲透與滯留增強(qiáng)效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect， EPR）在腫瘤組織間隙內(nèi)蓄積，不再局限于血池顯像［2］。而結(jié)合特定抗體或配體的靶向納米微泡造影劑，在腫瘤等疾病的早期診斷及靶向治療方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。CD147屬于免疫球蛋白家族，是一種跨膜糖蛋白，在HCC細(xì)胞高度表達(dá)并與HCC進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)［3］。本研究擬制備一種靶向CD147的納米級(jí)微泡造影劑，并檢測(cè)其理化性質(zhì)、超聲成像能力，以及其與HCC細(xì)胞特異性結(jié)合的能力，以期為臨床HCC診療監(jiān)測(cè)提供一種納米級(jí)超聲分子探針。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料全氟丙烷購自上海上氟科技有限公司，香豆素-6購自比迪生物科技（上海）有限公司，聚乙烯醇（PVA，分子量3 000）購自Sigma 公司，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基（DSPE-PEG2000-COOH）購自上海士宇生物技術(shù)有限公司；卵磷脂購自Alfa Aesar公司；聚乳酸-羥基乙酸-聚乙二醇共聚物（PLGA-PEG）購自上海舜納生物科技有限公司；CD147抗體購自神州細(xì)胞生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備Mastersizer 3000激光粒度儀購自英國馬爾文公司；SB20001電子天平購自上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司，超聲破碎儀購自寧波洛尚智能科技有限公司；TGL20MW臺(tái)式離心機(jī)購自湖南赫西儀器裝備有限公司；JEOL2010透射電子顯微鏡購自日本電子株式會(huì)社；攪拌器購自上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司。

1.3 制 備 方 法將30 mg PLGA-PEG、15 mg DSPE-PEG2000-COOH溶解于含1.5 mL二氯甲烷的三頸瓶中，加入150 μL全氟丙烷飽和水溶液，于100 W超聲破碎儀中冰浴乳化5 min，通入全氟丙烷氣體，加入5 mL 3%聚乙烯醇再次超聲乳化5 min。二次乳化懸液中再次加入20 mL全氟丙烷飽和1%聚乙烯醇溶液，400r/min攪拌過夜；11 180×g離心10 min，去除聚乙烯醇，制得全氟丙烷超聲納米微泡。將納米微泡以嗎啉乙磺酸（MES）緩沖溶液（pH＝5）透析過夜，加入EDC 孵育 2 h以活化表面羧基；調(diào)整溶液pH至7.0，加入0.1 mg CD147抗體（偶聯(lián)反應(yīng)）過夜。以Sephadex G25凝膠層析柱分離去除游離抗體，獲得靶向CD147超聲納米微泡，濃縮至5×108個(gè)/mL，分裝于5 mL西林瓶中（每瓶2 mL），充入全氟丙烷氣體4℃密閉保存。

1.4 理化性質(zhì)檢測(cè)檢測(cè)納米微泡粒徑電位表征：納米微泡制備后1 d及3 d時(shí)，用適量純水稀釋，通過激光粒度儀檢測(cè)溶液中靶向納米囊泡及未修飾納米囊泡的粒徑、電位及多分散系數(shù)。

1.5 靶向MHCC-97H細(xì)胞能力檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長期的MHCC-97H細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞鋪于共聚焦培養(yǎng)皿，過夜。次日，在孔中加入50 μL香豆素6熒光標(biāo)記的靶向及非靶向超聲微泡，并設(shè)置0.9%氯化鈉液陰性對(duì)照。處理后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h，以PBS洗滌2次后，用4%甲醛溶液室溫固定20 min；磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，DAPI染色15 min，PBS洗滌2次。最后，每孔加入PBS，通過共聚焦顯微鏡拍攝，ImageJ軟件分析微泡/核熒光強(qiáng)度比值。

1.6 超聲成像能力檢測(cè)備用納米微泡用PBS稀釋（1∶100），注入專用瓊脂模具中。采用Canon Aplio i500超聲儀，14L5探頭，將超聲探頭置于微泡溶液表面，檢測(cè)微泡超聲成像能力。用裸鼠制作MHCC-97H皮下移植瘤模型，經(jīng)裸鼠尾靜脈注射按1∶10稀釋的納米微泡50 μL，啟動(dòng)超聲造影模式，機(jī)械指數(shù)（MI）設(shè)為0.1，焦點(diǎn)設(shè)置于腫瘤稍下方，觀察腫瘤成像效果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 微泡理化性質(zhì)結(jié)果（表1）顯示：制備完成的微泡溶液在全氟丙烷氣體中4℃密閉保存后 1 d及3 d，粒徑大小均一，電位及聚合物分散性指數(shù)（PDI）未見明顯變化。

表1 靶向與非靶向CD147納米微泡理化性質(zhì)比較

2.2 靶向CD147納米微泡的細(xì)胞水平尋靶能力共聚焦顯微鏡下觀察（圖1）發(fā)現(xiàn)：靶向微泡較非靶向納米微泡能更高效地與MHCC-97H細(xì)胞結(jié)合（微泡/核熒光強(qiáng)度比值：1.18±0.36vs0.15±0.04，P＜0.01）。

圖1 共聚焦顯微鏡下觀察納米微泡靶向MHCC-97H的能力

2.3 納米微泡體外超聲成像超聲成像（圖2）顯示：靶向與非靶向納米微泡制備后1、3 d均勻分布于用PBS溶液中。

圖2 納米微泡體外超聲成像圖

2.4 靶向CD147微泡裸鼠皮下移植瘤內(nèi)超聲造影成像超聲造影（圖3）顯示：靶向與非靶向納米微泡制備后1、3 d，在裸鼠移植瘤模型體內(nèi)均有較好的超聲成像效果。

圖3 納米微泡注射于裸鼠MHCC-97H皮下移植瘤模型后超聲造影（左側(cè)）及基波超聲成像（右側(cè)）

3 討 論

靶向納米微泡通過將納米微泡與多肽或抗體偶聯(lián)，進(jìn)而能與癌細(xì)胞表面過表達(dá)的生物標(biāo)志物緊密結(jié)合，實(shí)現(xiàn)分子成像。其顯像功能較傳統(tǒng)超聲造影技術(shù)特異度和靈敏度更高，使活體組織或病灶細(xì)胞的抗原表位可視化并有助于定量分析，有利于臨床實(shí)施針對(duì)性治療及療效評(píng)估，且臨床風(fēng)險(xiǎn)?。?-5］。

CD147在腫瘤病理免疫組化檢查中陽性率很高，達(dá)75%。CD147在腫瘤組織中的表達(dá)陽性率明顯高于癌旁組織［6］。HAb18G/CD147 是從HCC細(xì)胞cDNA庫中篩選出來的一種抗原，其編碼序列與 CD147相似，是CD147家族的新成員［7］。HAb18G/CD147 廣泛表達(dá)于多種HCC細(xì)胞系，但不表達(dá)于LO2人類正常肝細(xì)胞系，且表達(dá)于74.0%（37/50）HCC患者的腫瘤細(xì)胞膜［8］。CD147可反映HCC細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，同時(shí)參與HCC血管生長和耐藥性形成過程［3］。目前，有關(guān)靶向CD147的納米微泡超聲造影劑用于腫瘤的報(bào)道較少。Liu等［9］制備了一種靶向CD147的納米微泡；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該納米微泡只與HCC細(xì)胞結(jié)合而不與正常肝細(xì)胞結(jié)合，本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)靶向CD147微泡能特異性結(jié)合于HCC細(xì)胞表面；在裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，靶向納米微泡也獲得了較好的超聲成像效果。后續(xù)研究將結(jié)合超聲定量參數(shù)分析靶向與非靶向微泡的成像差異。

微泡的粒徑、電位的穩(wěn)定性、超聲成像能力決定其是否可作為合格的分子探針應(yīng)用于超聲分子顯像及靶向治療。本研究研制的靶向CD147微泡理化性質(zhì)穩(wěn)定，在4℃及充滿全氟丙烷的密閉環(huán)境中保存1 d及3 d后，其物理性質(zhì)均未明顯變化，與李翠仙等［10］制備的超聲微泡類似，且在體外及裸鼠體內(nèi)均表現(xiàn)良好的超聲成像能力。

綜上所述，本研究制備了一種通過靶向CD147特異結(jié)合于HCC細(xì)胞的納米微泡，該微泡大小、分布均勻，穩(wěn)定性好，在體外及裸鼠體內(nèi)均有良好的超聲成像能力，保存3 d后性能仍穩(wěn)定，是一種較為理想的超聲分子造影劑，為HCC分子顯像及治療提供了新方向。后續(xù)通過分析其不同時(shí)間點(diǎn)的超聲成像灰度值，有利于腫瘤超聲定量 分析。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。