潘統(tǒng)鶴，黃亞特 綜述 南開輝 審校

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院，附屬眼視光醫(yī)院眼科生物材料實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027；2.眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027)

人類所獲知的感知信息80%來源于視覺，因此依賴于視神經(jīng)進(jìn)行傳遞的視覺信息對(duì)人類至關(guān)重要，而視神經(jīng)由于其胚胎起源和細(xì)胞組成而成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)不可或缺的部分，并且像大多數(shù)成熟哺乳動(dòng)物的CNS一樣，視神經(jīng)如果受到損傷，其再生能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于周圍神經(jīng)(peripheral nervous system，PNS)的再生[1]。由青光眼、顱腦外傷以及各種缺血性、遺傳性、神經(jīng)性疾病等造成的視神經(jīng)損傷，使視功能嚴(yán)重受損[2-4]，而這種損傷往往導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)原發(fā)性或繼發(fā)性死亡，最終視神經(jīng)變性壞死而致盲。因此針對(duì)視神經(jīng)損傷后再生的基礎(chǔ)研究對(duì)于重建患者失去的視功能具有重大意義。很長(zhǎng)時(shí)間以來，研究者們一直認(rèn)為包括視神經(jīng)在內(nèi)的CNS較弱的再生能力是中樞神經(jīng)元細(xì)胞的固有特點(diǎn)，但Richardson等[5]的研究結(jié)果證實(shí)：中樞神經(jīng)軸突可以再生并長(zhǎng)入周圍神經(jīng)移植物內(nèi)，暗示損傷局部微環(huán)境因素，如炎癥信號(hào)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、凋亡和抗凋亡穩(wěn)態(tài)失衡等，同樣影響著CNS軸突再生，這個(gè)重大發(fā)現(xiàn)改變了人們的看法并嘗試進(jìn)行CNS軸突再生研究。由于視神經(jīng)獨(dú)特的可及性，相對(duì)簡(jiǎn)單的解剖結(jié)構(gòu)和功能評(píng)價(jià)的便利性，其已成為CNS軸突再生主要的研究對(duì)象之一[6]。近年來，研究者們從多方面開展了視神經(jīng)保護(hù)和損傷修復(fù)的深入研究，并取得了一定成果。本文將從調(diào)控炎癥刺激、不同方式提供內(nèi)源性或外源性細(xì)胞因子抑制凋亡等促進(jìn)視神經(jīng)再生、抗氧化藥物應(yīng)用減少氧化應(yīng)激保護(hù)RGCs、干細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)或分化補(bǔ)充凋亡的RGCs，以及基因調(diào)控RGCs重編程促進(jìn)再生等方面對(duì)視神經(jīng)損傷后修復(fù)再生進(jìn)行綜述。

1 抑制視神經(jīng)再生的因素

視神經(jīng)再生研究一般包含如下3個(gè)方面：1)避免視神經(jīng)損傷后的RGCs凋亡，即RGCs保護(hù)。在視神經(jīng)損傷后常伴隨炎癥及氧化損傷，可激活RGCs的凋亡程序，促使RGCs凋亡，而大量RGCs凋亡必然影響視神經(jīng)功能，因此避免RGCs凋亡至關(guān)重要。2)促使RGCs軸突沿視神經(jīng)方向再生，即軸突定向生長(zhǎng)。視神經(jīng)損傷后，軸突斷裂，視神經(jīng)變性壞死失去功能，需要新生軸突重建功能。3)重建新生軸突的視覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，即視功能重建。在促使RGCs軸突定向再生形成新生神經(jīng)元后，還需要與腦部建立功能性連接以轉(zhuǎn)導(dǎo)視覺信號(hào)，才能改善受損的視功能。視神經(jīng)再生研究策略示意圖見圖1。

圖1 視神經(jīng)再生研究策略示意圖Figure 1 Research strategies for optic nerve regeneration

視神經(jīng)再生存在許多限制因素，可分為內(nèi)在因素和外在因素。內(nèi)在因素主要表現(xiàn)為RGCs在分化成熟的同時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)程序向抑制增殖轉(zhuǎn)變[7]。例如環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、mTOR/PTEN、Kruppel樣因子4(Kruppel-like factors 4，KLF4)等可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)和表觀遺傳改變，這些改變與中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟密切相關(guān)[8-10]。

外在因素主要體現(xiàn)在視神經(jīng)再生的抑制性微環(huán)境，主要包括慢性炎癥及氧化損傷、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、RGCs損傷凋亡、髓鞘蛋白高表達(dá)和損傷處神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成等。視神經(jīng)損傷后，軸突運(yùn)輸功能障礙導(dǎo)致神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏，引起RGCs凋亡。而RGCs凋亡會(huì)上調(diào)凋亡相關(guān)信號(hào)通路(p53、Bax)的下游因子，增加RGCs氧化應(yīng)激水平，進(jìn)一步促進(jìn)RGCs凋亡[4,11]。在正常情況下，髓鞘能夠隔離軸突，并加速電傳導(dǎo)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，髓鞘由少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，受到損傷后少突膠質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)髓鞘蛋白。而這些髓鞘蛋白碎片已被驗(yàn)證為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突生長(zhǎng)的最主要抑制劑之一。例如，Vajda等[12]報(bào)道少突膠質(zhì)細(xì)胞上高度表達(dá)的髓鞘相關(guān)蛋白(Nogo)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生的一個(gè)主要抑制劑。此外，其他髓鞘蛋白如髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘相關(guān)糖蛋白(OMgp)、酪氨酸蛋白激酶B3(ephrin B3)等都被證明與抑制軸突生長(zhǎng)相關(guān)[6,13-16]。同時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后髓鞘碎片清除效率降低容易導(dǎo)致外環(huán)境髓鞘蛋白堆積，髓鞘蛋白不僅能夠抑制軸突再生，更能夠激活凋亡級(jí)聯(lián)，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)元凋亡[15]。

視神經(jīng)損傷后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，上調(diào)多種軸突生長(zhǎng)抑制因子，并促進(jìn)硫酸軟骨素蛋白聚糖及反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞形成膠質(zhì)瘢痕[17-18]。神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕中含有多種抑制軸突再生因子包括硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondro it in sul fate proteoglycan，CSPG)、信號(hào)蛋白3A(Sema3A)和腱生蛋白-R(TN-R)等，是視神經(jīng)軸突再生的不適宜環(huán)境，也是其生長(zhǎng)的物理屏障[19-22]。

基于上述的困難和限制，近年來開展了許多相關(guān)的基礎(chǔ)研究并取得較好的成果。表1對(duì)近年來視神經(jīng)再生研究策略及研究結(jié)果進(jìn)行了匯總。

表1 視神經(jīng)再生研究進(jìn)展Table 1 Research progress of optic nerve regeneration

續(xù)表1

2 抗氧化藥物減少氧化應(yīng)激

視神經(jīng)軸突富含線粒體，因此對(duì)缺血、缺氧更為敏感。視神經(jīng)損傷后，由于缺乏氧氣及炎癥激發(fā)，損傷視神經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重的活性氧(reactive oxygen，ROS)積累，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致RGCs自噬失衡，并進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥升級(jí)，促進(jìn)RGCs凋亡。使用抗氧化藥物減輕ROS積累及氧化應(yīng)激損傷，有助于保護(hù)RGCs存活。維生素C能抑制細(xì)胞釋放超氧根離子，提高谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性，從而清除細(xì)胞內(nèi)外的氧自由基。維生素C和維生素E合用有協(xié)同作用，可有效防止脂類過氧化，有效降低視神經(jīng)損傷后RGCs的氧化應(yīng)激水平，減少RGCs凋亡。Zanon-Moreno等[35]的研究表明：血液中高水平維生素C和維生素E能夠降低青光眼患病風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)視神經(jīng)功能。此外，Ekicier Acar等[23]發(fā)現(xiàn)：局部聯(lián)合使用輔酶Q10與維生素E能有效降低視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜內(nèi)Iba1(小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白)的表達(dá)，并能夠上調(diào)Bcl-xL蛋白水平從而減少RGCs的凋亡。Williams等[23]報(bào)道維生素B3能在糖代謝中發(fā)揮重要作用，可以維持線粒體的活性，避免RGCs的凋亡。除了應(yīng)用維生素類藥物，也有研究[25,36-37]通過遞送其他抗氧化藥物如超氧化物歧化酶(SOD)、曲美他嗪(TMZ)、氨基葡萄糖(GlcN)等抵抗損傷后RGCs中的氧化應(yīng)激，提高RGCs的存活率。然而視神經(jīng)損傷后，損傷的視神經(jīng)長(zhǎng)期處于慢性炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)，抗氧化藥物的應(yīng)用僅能在短時(shí)間內(nèi)緩解RGCs的氧化損傷，無法長(zhǎng)期發(fā)揮作用。

3 提供外源性細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞或者非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化成熟、功能維持、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷愈合和腫瘤消長(zhǎng)等功能[38]。

紅細(xì)胞生成素(erythrogenin，EPO)是一種內(nèi)源性的糖蛋白激素，屬于細(xì)胞因子I型超家族，有多篇研究報(bào)道EPO能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)和抗凋亡作用，并能在損傷后緩解神經(jīng)毒性或缺血[39-41]。而后，Hernández等[42]報(bào)道了EPO產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)和抗凋亡作用的機(jī)制可能是通過JANUS激酶2(JAK2)磷酸化，激活PI3-K、MAPK和STAT5通路，并通過Wnt1維持線粒體膜電位、磷酸化和促進(jìn)Bad從線粒體向細(xì)胞質(zhì)的易位、減少Bad/Bcl-xL復(fù)合物的形成和增加Bcl-xL/Bax復(fù)合物的形成，從而調(diào)節(jié)凋亡級(jí)聯(lián)。此外，Kucuk等[41]報(bào)道EPO在包括視網(wǎng)膜和視神經(jīng)在內(nèi)的不同組織中具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。隨后，在Kashkouli等[39]進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中，使用EPO對(duì)外傷性視神經(jīng)病變(traumatic optic neuropathy，TON)具有顯著的治療效果，與對(duì)照組相比在矯正視力和色覺上具有顯著差異且無明顯的不良反應(yīng)。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是一類由神經(jīng)元靶細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)或多肽分子，包括腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)等，能與相應(yīng)受體特異性結(jié)合，被軸突末端攝取，經(jīng)軸漿逆行運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體，發(fā)揮維持神經(jīng)元存活和促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的作用[43]。視神經(jīng)損傷后RGCs發(fā)生凋亡，而視網(wǎng)膜過表達(dá)BDNF能夠有效保護(hù)RGCs的存活[44-46]。Sánchez-Migallón等[27]發(fā)現(xiàn)BDNF能夠顯著改善視神經(jīng)夾傷動(dòng)物模型的RGCs存活數(shù)量。在Duprey-Díaz等[47]的報(bào)道中，F(xiàn)GF-2和FGF受體上調(diào)對(duì)RGCs軸突再生具有重要意義。CNTF在過去通常被用來治療肌萎縮側(cè)索硬化癥。直到1994年，Unoki等[48]報(bào)道了視網(wǎng)膜損傷后CNTF與CNTF受體表達(dá)均會(huì)上調(diào)，發(fā)現(xiàn)了CNTF在視網(wǎng)膜及視神經(jīng)再生的應(yīng)用潛能。隨后，Vega-Meléndez等[49]在2014年報(bào)道在視神經(jīng)橫斷后給予CNTF能夠抑制RGCs的凋亡并促進(jìn)軸突再生。Wang等[50]發(fā)現(xiàn)CNTF發(fā)揮作用可能與RhoA通路相關(guān)，通過使用生長(zhǎng)抑制因子如Nogo、OMgp和MAG激活RhoA信號(hào)通路可顯著降低CNTF對(duì)RGCs存活和再生的積極作用。

目前，NGF已應(yīng)用于臨床，并取得了較好的療效[51-53]。相關(guān)的臨床試驗(yàn)如重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療視神經(jīng)損傷也在進(jìn)行中(臨床研究編號(hào)：CTR20191810、CTR20201202、NCT04232332)。但NGF治療也存在較多局限，例如NGF緩解RGCs凋亡效果較為短暫，需要持續(xù)給藥維持效果；同時(shí)NGF難以通過血眼屏障，需要頻繁進(jìn)行玻璃體腔內(nèi)注射，也給患者帶來了痛苦。為解決此問題，也有研究采用轉(zhuǎn)基因高表達(dá)的方式提供內(nèi)源性NGF以達(dá)到持續(xù)給藥的目的[46]。

4 炎癥刺激激活再生

炎癥刺激對(duì)于視神經(jīng)再生而言是一把雙刃劍，一方面，過度的炎癥刺激會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡及膠質(zhì)瘢痕的形成阻礙軸突在損傷部位的再生[54]；另一方面，適宜的炎癥刺激也會(huì)帶來重要的細(xì)胞信號(hào)，激活RGCs軸突再生通路。例如在誘導(dǎo)眼內(nèi)炎(如晶狀體損傷、酵母聚糖注射)情況下，炎癥刺激可促進(jìn)多種利于軸突再生的細(xì)胞因子釋放，如CNTF、白血病抑制因子和白細(xì)胞介素6(IL-6)等。同時(shí)，炎癥刺激持續(xù)激活了多種信號(hào)通路，如JAK/STAT3和PI3K/AKT/mTOR，表現(xiàn)出了RGCs保護(hù)和軸突再生的作用[55]。此外，視神經(jīng)損傷后向玻璃體腔內(nèi)注射酵母多糖能夠上調(diào)癌調(diào)蛋白的表達(dá)。癌調(diào)蛋白是一種鈣結(jié)合蛋白，由視網(wǎng)膜上巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌，能夠協(xié)同cAMP促進(jìn)視神經(jīng)軸突再生，相較單獨(dú)使用cAMP或其他生長(zhǎng)因子，視神經(jīng)再生效果顯著提升[30,56]。然而，對(duì)于癌調(diào)蛋白是否是酵母聚糖誘導(dǎo)視神經(jīng)再生的關(guān)鍵因素仍然存在巨大爭(zhēng)議，并且炎癥刺激是如何通過復(fù)雜調(diào)控實(shí)現(xiàn)再生的也需要更多研究探索。

5 抗膠質(zhì)瘢痕形成

神經(jīng)損傷處膠質(zhì)瘢痕形成是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，伴有膠質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的參與。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞和外周的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、軟腦膜細(xì)胞及纖維母細(xì)胞向損傷灶周圍聚集，成為膠質(zhì)基質(zhì)層的組成部分[57]。損傷引起炎癥反應(yīng)，活化的炎癥細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，促進(jìn)了損傷區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生并向損傷部位的遷移，最終形成膠質(zhì)瘢痕。

膠質(zhì)瘢痕是中樞神經(jīng)包括視神經(jīng)在內(nèi)軸突再生的巨大障礙，如CSPG能夠顯著抑制軸突再生。但在單層的星形膠質(zhì)細(xì)胞上，神經(jīng)細(xì)胞的突起能很好地生長(zhǎng)。這是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞具有合成和分泌營(yíng)養(yǎng)因子的功能?，F(xiàn)有觀點(diǎn)[58]認(rèn)為以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主的膠質(zhì)瘢痕對(duì)于再生軸突重建具有阻礙軸突穿越的作用，但同時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)中樞神經(jīng)軸突再生起促進(jìn)作用。已有研究[59-63]表明參與膠質(zhì)瘢痕形成的細(xì)胞因子有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、bFGF、FGF-2、IL-1β、IL-6、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)、膠質(zhì)細(xì)胞成熟因子、血栓素、表皮生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子等，其中部分細(xì)胞因子具有一定的促進(jìn)RGCs存活和軸突再生的作用。因此無法單純通過去除星形膠質(zhì)細(xì)胞以抑制膠質(zhì)瘢痕形成。而如何在抑制膠質(zhì)瘢痕產(chǎn)生的同時(shí)保留星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用是當(dāng)下研究的重點(diǎn)。Pearson等[18]發(fā)現(xiàn)：通過芳基硫酸酯酶B能夠有效降低視神經(jīng)損傷后膠質(zhì)瘢痕形成及CSPG對(duì)視神經(jīng)軸突的再生抑制作用，顯著增強(qiáng)了酵母聚糖促進(jìn)視神經(jīng)軸突再生的作用。Frik等[58]發(fā)現(xiàn)減少單核細(xì)胞浸潤(rùn)能有效促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖，減少膠質(zhì)瘢痕生成并保留星形膠質(zhì)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)效果。

6 干細(xì)胞移植

視神經(jīng)再生的干細(xì)胞移植研究可分為2種。一種是移植具有分化潛能的多功能干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和視網(wǎng)膜干細(xì)胞(retinal stem cells，RSCs)等，并通過誘導(dǎo)分化使其移行整合到宿主的視網(wǎng)膜上，補(bǔ)充凋亡的RGCs及生成新生的軸突；一種是通過移植間充質(zhì)干細(xì)胞包括脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、臍血干細(xì)胞(umbilical cord blood stem cells，UCBSCs)等，對(duì)損傷后的神經(jīng)元細(xì)胞給予炎癥調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)支持[32,64-68]。

ESCs是從早期胚胎或者早期性腺分離出的一類干細(xì)胞，早在1998年便可被分離和克隆。ESCs可分化為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，形成形態(tài)類似RGCs和表達(dá)RGCs特性的細(xì)胞，并能夠與宿主視網(wǎng)膜結(jié)合。RSCs在正常視網(wǎng)膜的微環(huán)境下處于相對(duì)靜默狀態(tài)，但在特殊的環(huán)境下可以分化為RGCs。RSCs分化能力的激活可能與Wnt和Shh信號(hào)途徑在睫狀體邊緣區(qū)域的高表達(dá)相關(guān)?；贓SCs、RSCs具有分化RGCs的潛能，有研究者[67,69]將ESCs或RSCs誘導(dǎo)分化培養(yǎng)成視網(wǎng)膜器官，有望運(yùn)用于視網(wǎng)膜、視神經(jīng)疾病的治療。但多功能干細(xì)胞分化治療仍面臨巨大的障礙，例如細(xì)胞移行與宿主視網(wǎng)膜的整合、神經(jīng)元軸突的定向再生、移植干細(xì)胞的增生調(diào)控等[70]。

多種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞如骨髓、脂肪組織、臍帶血和牙齒(牙髓和牙周膜)來源的干細(xì)胞能在視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型中起到促進(jìn)RGCs存活和神經(jīng)保護(hù)的作用[32,45,71-72]。Cen等[32]在視神經(jīng)夾傷大鼠的玻璃體腔內(nèi)注射人牙周膜干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著提高視神經(jīng)損傷后RGCs的存活并促進(jìn)軸突再生，同時(shí)在體外與視網(wǎng)膜外植體共培養(yǎng)也能促進(jìn)RGCs存活及軸突再生且不發(fā)生炎癥反應(yīng)。然而Chen等[66]認(rèn)為雖然間充質(zhì)干細(xì)胞的確對(duì)視神經(jīng)損傷后的RGCs具有保護(hù)和軸突再生的積極作用，但只是短暫的促進(jìn)作用，在更長(zhǎng)期的觀察中與對(duì)照無明顯差異。

7 基因及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控

隨著生長(zhǎng)發(fā)育的成熟，RGCs再生能力下降，其可能機(jī)制為基因表達(dá)改變促使成熟RGCs抑制生長(zhǎng)環(huán)境形成及發(fā)育依賴性的再生能力下降。因此，通過調(diào)控特定基因及信號(hào)通路，可以逆轉(zhuǎn)視神經(jīng)軸突的再生抑制，從而促進(jìn)視神經(jīng)再生。目前，對(duì)于視神經(jīng)再生的基因及信號(hào)通路的基礎(chǔ)研究較多，例如cAMP、PTEN/mTOR、APC-Cdh1、KLF-4、Melanopsin/GPCR、MDM4/MDM2-p53-IGF1等都被報(bào)道與中樞神經(jīng)發(fā)育依賴性生長(zhǎng)能力下降和促進(jìn)神經(jīng)軸突再生相關(guān)[17,73-74]。重組腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)載體是目前眼科基因治療研究中最常用的載體，通過將治療基因?qū)氩《揪幋a序列并轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，過表達(dá)或沉默相關(guān)基因，從而促進(jìn)RGCs的存活及軸突再生[32]。Park等[75]發(fā)現(xiàn)激活mTOR通路可以促進(jìn)中樞神經(jīng)保護(hù)和軸突再生，此積極作用與PTEN基因下調(diào)關(guān)系密切。之后，Sun等[34]進(jìn)一步報(bào)道分別激活mTOR、JAK/STAT通路或敲除SOCS3、PTEN均可以促進(jìn)視神經(jīng)軸突顯著再生，但再生效率在2周后發(fā)生下降。而同時(shí)敲除SOCS3和PTEN可以顯著增強(qiáng)RGCs軸突再生能力，說明SOCS3和PTEN是兩個(gè)相互獨(dú)立的通路，可以協(xié)同促進(jìn)視神經(jīng)軸突的再生。Liu等[74]將AAV-mela注入玻璃體腔感染視網(wǎng)膜中的RGCs，使其高表達(dá)黑色素(melanopsin)，并上調(diào)M1-M3 ipRGCs的mTOR表達(dá)，能夠有效保護(hù)視神經(jīng)損傷大鼠RGCs的存活并促進(jìn)軸突的再生。Chiha等[76]發(fā)現(xiàn)：在玻璃體腔內(nèi)注射AAV-BDNF或AAV-CRMP2能夠保護(hù)視神經(jīng)損傷后RGCs，穩(wěn)定軸突及髓鞘。Sinclair課題組[33]通過AAV介導(dǎo)Oct4(Pou5f1)、Sox2和Klf4基因(OSK)在小鼠RGCs中異位表達(dá)，促進(jìn)損傷后軸突的再生，并逆轉(zhuǎn)青光眼小鼠和老年小鼠的視力喪失。

KLF是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及胚胎發(fā)育等多個(gè)生命活動(dòng)的調(diào)控。Moore等[77]研究發(fā)現(xiàn)：KLF家族成員能在不同程度上抑制或增強(qiáng)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的生長(zhǎng)，其中有幾種生長(zhǎng)抑制KLF在出生后上調(diào)，而生長(zhǎng)促進(jìn)KLF則下調(diào)。同時(shí)，KLF4是RGCs和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，KLF4敲除能在體外及體內(nèi)促進(jìn)視神經(jīng)損傷后RGCs軸突的再生。隨后，Qin等[78]報(bào)道KLF4敲除是通過JAK-STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)視神經(jīng)損傷后RGCs軸突再生的。同時(shí)，采用外源性細(xì)胞因子處理或去除內(nèi)源性JAK-STAT3通路抑制劑(SOCS3)可加強(qiáng)此積極效應(yīng)。但由于目前技術(shù)及操作難以在實(shí)際臨床的應(yīng)用中做到準(zhǔn)確的條件性基因敲除，因此此種方式僅限于基礎(chǔ)研究未在臨床上得到廣泛應(yīng)用。

8 定向誘導(dǎo)軸突再生

盡管上述方式能夠較好地保護(hù)RGCs并有效促進(jìn)軸突再生，但軸突再生仍然缺少定向生長(zhǎng)，即向顱腦靶區(qū)生長(zhǎng)的能力。如Pernet等[79]發(fā)現(xiàn)通過AAV2-CNTF的基因治療能夠有效保護(hù)神經(jīng)并促進(jìn)軸突再生，然而在更長(zhǎng)時(shí)間后新生軸突生長(zhǎng)方向出現(xiàn)了U型迂回，向視網(wǎng)膜中生長(zhǎng)，并在視網(wǎng)膜內(nèi)表面形成了密集的神經(jīng)叢。因此，成功的視神經(jīng)再生不僅是促進(jìn)視神經(jīng)軸突再生，還需要能夠誘導(dǎo)再生軸突定向生長(zhǎng)的信號(hào)。外加直流電場(chǎng)刺激在1981年便被報(bào)道為具有能夠有效刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突定向再生的應(yīng)用潛能[80]。之后，Gokoffski等[81]報(bào)道了外加直流電場(chǎng)能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜外植體新生軸突向陰極方向生長(zhǎng)，此種趨電效應(yīng)與Rho GTPase信號(hào)的激活密切相關(guān)。然而外加直流電場(chǎng)在視神經(jīng)方面應(yīng)用還僅限于體外方面，體內(nèi)應(yīng)用仍存在巨大的限制和難點(diǎn)。

近年來，在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用下，納米圖案化或三維支架有望能引導(dǎo)軸突定向再生。Ellis-Behnke等[82]報(bào)道了一種自組裝肽納米纖維支架能夠?yàn)檩S突再生創(chuàng)造了一個(gè)有利環(huán)境，新生軸突不僅可以通過急性損傷部位，還可以與腦組織連接在一起，以促進(jìn)視覺功能的恢復(fù)。此外，Yang等[83]利用納米圖案化技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)模擬體外組織微結(jié)構(gòu)的支架，成功引導(dǎo)人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)衍生的RGCs軸突沿著支架溝槽定向生長(zhǎng)。

9 新生軸突與腦靶區(qū)的連結(jié)及視功能重建

目前的基礎(chǔ)研究在針對(duì)視神經(jīng)損傷后RGCs的保護(hù)及軸突再生方面已取得較多進(jìn)展。當(dāng)視神經(jīng)新生軸突再生至靶組織時(shí)，如何重新建立軸突與靶組織之間的功能性聯(lián)系對(duì)于視神經(jīng)功能恢復(fù)至關(guān)重要。Bei等[84]報(bào)道：將PTEN和SOCS3共敲除或?qū)⒐菢虻鞍?、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、CNTF共過表達(dá)均能促進(jìn)視神經(jīng)損傷后軸突的生長(zhǎng)，同時(shí)新生的視網(wǎng)膜再生軸突能夠抵達(dá)上丘形成功能性突觸，但僅能恢復(fù)部分的視覺功能，其原因是再生軸突缺乏髓鞘而不能將動(dòng)作電位從視網(wǎng)膜有效地傳導(dǎo)至上丘，通過使用鉀離子通道阻滯劑可恢復(fù)動(dòng)作電位的傳導(dǎo)，顯著提高視覺能力。此外，視覺刺激或化學(xué)遺傳刺激也被認(rèn)為與RGCs的活性密切相關(guān)。Lim等[85]報(bào)道通過視覺刺激視神經(jīng)，同時(shí)結(jié)合激活的mTOR通路可以促進(jìn)RGCs軸突與大腦建立功能性連接，進(jìn)而恢復(fù)部分視覺功能。

10 結(jié)語

隨著視神經(jīng)再生研究的不斷開展，逐步揭示了視神經(jīng)損傷后涉及的凋亡和再生機(jī)制，但各方面研究仍存在局限性。例如抗氧化藥物僅針對(duì)視神經(jīng)損傷后RGCs的氧化損傷，不能夠進(jìn)一步地促進(jìn)軸突再生，并且藥物的長(zhǎng)期遞送和釋放也是限制其進(jìn)一步發(fā)展的原因；細(xì)胞因子盡管已部分在臨床中應(yīng)用，且有部分新藥已進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)階段，但長(zhǎng)期療效仍有待進(jìn)一步檢驗(yàn)和提高；炎癥刺激目前僅停留在基礎(chǔ)研究方面，何種程度的炎癥能夠避免炎癥損傷并促進(jìn)軸突再生仍需要更多研究探明。而炎癥刺激產(chǎn)生的不良反應(yīng)也限制了其走向臨床；膠質(zhì)瘢痕的生成與許多軸突再生相關(guān)細(xì)胞因子及營(yíng)養(yǎng)支持細(xì)胞有關(guān)，因此需要在抗膠質(zhì)瘢痕生成和軸突營(yíng)養(yǎng)再生中尋找平衡。同時(shí)單純的抗膠質(zhì)瘢痕生成難以達(dá)到促進(jìn)軸突再生效果，需與其他促再生方式聯(lián)合；得益于干細(xì)胞的炎癥調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)支持以及移植替換等功能，干細(xì)胞治療已在視神經(jīng)再生的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域取得了較好的成果。但干細(xì)胞治療的長(zhǎng)期效果以及干細(xì)胞本身的長(zhǎng)期跟蹤也是需要未來臨床應(yīng)用需要面對(duì)的難題；基因治療是目前視神經(jīng)再生基礎(chǔ)研究中促進(jìn)軸突再生能力最強(qiáng)的方式，能夠有力并且持久地促進(jìn)軸突再生。目前已有基因治療被批準(zhǔn)應(yīng)用于眼病，同時(shí)，約有25種眼科疾病基因療法處于I期、II期或III期[86]。因此，基因治療可能是未來最具有向臨床轉(zhuǎn)化前景的視神經(jīng)再生方式；納米生物材料支架有望被應(yīng)用于誘導(dǎo)中樞神經(jīng)軸突定向再生，但目前相關(guān)進(jìn)展及成果大多在于脊髓或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)。由于視神經(jīng)相對(duì)于其他中樞神經(jīng)的特殊性(胞體位于視網(wǎng)膜內(nèi))及支架移植困難，導(dǎo)致目前視神經(jīng)支架誘導(dǎo)軸突再生的研究大多停留在體外誘導(dǎo)水平，相關(guān)的體內(nèi)誘導(dǎo)研究仍然較少；而新生軸突與腦靶區(qū)的功能重建仍是目前視神經(jīng)再生的核心問題，目前僅僅是觀察到新生軸突穿過視交叉進(jìn)入腦部區(qū)域，對(duì)此的相關(guān)研究也未能闡明功能性突觸重建的機(jī)制和關(guān)鍵所在。因此后續(xù)仍需要更多的基礎(chǔ)研究探索此方向。

綜上，目前研究的熱點(diǎn)仍在于激活RGCs內(nèi)在再生能力、逆轉(zhuǎn)外在抑制生在環(huán)境，定向誘導(dǎo)軸突再生，以及與大腦建立功能性連接這幾個(gè)方面，而如何同時(shí)協(xié)調(diào)各方面的聯(lián)合治療，從而實(shí)現(xiàn)視功能恢復(fù)將是未來研究的重點(diǎn)所在。

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