王 淼，衣萌萌，王瑞寧，盧邁新

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380）

【研究意義】池塘養(yǎng)殖是我國(guó)水產(chǎn)品供應(yīng)的重要來(lái)源。目前傳統(tǒng)的池塘養(yǎng)殖模式仍然是我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖模式。2020 年我國(guó)淡水池塘養(yǎng)殖面積為262.54 萬(wàn)hm2，占淡水養(yǎng)殖總面積的52.09%，池塘養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量為2 279.76 萬(wàn)t，占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的73.81%［1］。池塘保持一定厚度的底質(zhì)，可提供養(yǎng)分，穩(wěn)定水質(zhì)，是有益微生物和底棲生物生長(zhǎng)繁殖的場(chǎng)所，有利于養(yǎng)殖生物的生長(zhǎng)，但淤泥過(guò)厚給養(yǎng)殖水體帶來(lái)極大危害［2-3］。池塘底泥中的微生物作為分解者［4］，能轉(zhuǎn)化池塘生態(tài)系統(tǒng)中的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物，改變和調(diào)節(jié)養(yǎng)殖環(huán)境條件，并促進(jìn)物質(zhì)循環(huán)和浮游植物生長(zhǎng)；但底泥中有害微生物比例的增大可以改變水體和底泥的菌相組成，影響水質(zhì)和底質(zhì)，并導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物的粘膜系統(tǒng)菌群失衡，增加其感病風(fēng)險(xiǎn)。因此，池塘底泥微生物群落對(duì)維持池塘生態(tài)系統(tǒng)平衡具有重要意義，對(duì)其研究將可進(jìn)一步揭示底泥微生物的功能。

【前人研究進(jìn)展】微生物群落對(duì)Biolog-ECO板上31 種碳源的特征性利用稱作該微生物群落的代謝指紋圖譜［5］。利用Biolog-ECO 平板技術(shù)對(duì)養(yǎng)殖池塘環(huán)境微生物群落代謝功能的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)羅非魚養(yǎng)殖季節(jié)，池塘微生物群落對(duì)不同類型碳源的選擇有所不同，但池塘水體中的微生物數(shù)量和碳源代謝水平維持較穩(wěn)定的狀態(tài)［6］。羅非魚池塘底泥中異養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量在養(yǎng)殖周期基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，各月份間微生物對(duì)4 大類碳源的利用無(wú)明顯差異，對(duì)不同碳源的利用有差異［7］。Li 等［8］利用Biolog-ECO 平板研究了池塘循環(huán)水系統(tǒng)中微生物群落的代謝功能等。Sala 等［9］通過(guò)計(jì)算海水中微生物對(duì)Biolog-ECO 平板的氮利用指數(shù)來(lái)評(píng)估環(huán)境菌群對(duì)有機(jī)氮的處理能力，擴(kuò)展了Biolog-ECO 平板的用途。

【本研究切入點(diǎn)】底泥的微生物群落的相關(guān)研究包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式［10］、Biolog-ECO 平板技術(shù)［11］和高通量測(cè)序技術(shù)等［12］，但底泥中只有約0.25%的微生物是可培養(yǎng)的［13］。近年來(lái)隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，許多研究通過(guò)16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)研究了池塘底泥的微生物群落結(jié)構(gòu)［14-15］，但該方法得到的菌群結(jié)構(gòu)僅反映細(xì)菌的相對(duì)豐度，而無(wú)法了解菌群的功能，而Biolog-ECO 平板技術(shù)可以根據(jù)碳源類別分析底泥菌群功能，通過(guò)平均顏色變化率（Average Well Colour Development，AWCD）反映不同功能菌群的絕對(duì)豐度，并可以通過(guò)顯色反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物，是一種較好的底泥微生物群落研究技術(shù)。

【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘為研究對(duì)象，分析了養(yǎng)殖底泥中NH4-N、NO2-N、NO3-N 和TN 的動(dòng)態(tài)變化，利用Biolog-ECO 平板技術(shù)對(duì)池塘底泥中微生物的碳源代謝功能進(jìn)行探討，并進(jìn)一步分析了羅非魚養(yǎng)殖池塘底泥菌群對(duì)含氮碳源、含磷碳源和只含碳的碳源代謝的變化情況，以期為今后深入了解養(yǎng)殖環(huán)境中微生物群落對(duì)不同碳源的代謝功能與規(guī)律、構(gòu)建養(yǎng)殖環(huán)境微生態(tài)調(diào)控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇廣州市花都區(qū)祿仕食品有限公司的4 個(gè)羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘，分別編號(hào)為池塘1（0.88 hm2）、池塘2（0.57 hm2）、池塘3（0.69 hm2）和池塘4（0.53 hm2），各池塘的養(yǎng)殖密度均為44 776 條/hm2，按照魚體體重的2%～3%投喂，養(yǎng)殖產(chǎn)量為24.6 t/hm2。池塘于2019年2月進(jìn)行清塘、曬塘處理。

1.2 試驗(yàn)方法

分別于2019 年4 月17 日、7 月12 日和10月15 日從養(yǎng)殖池塘中采集泥樣。采集池塘四角池底表層10～15 cm 的底泥200 g 左右，用于底泥的理化指標(biāo)分析及Biolog-ECO 平板檢測(cè)。

1.2.1 底泥氮含量測(cè)定 將底泥晾干至質(zhì)量恒定后研磨成粉，取10 g，溶于100 mL 1 mol/L KCl，以160 r/min 震蕩處理1 h，取50 mL 懸濁液，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)定。采用納氏試劑光度法測(cè)定NH4-N 濃度，采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測(cè)定NO2-N 濃度，采用酚二磺酸光度法測(cè)定NO3-N 濃度，采用過(guò)硫酸鉀紫外分光光度法測(cè)定TN 濃度。

1.2.2 基于Biolog-ECO 技術(shù)的微生物功能多樣性測(cè)定 取5 g 泥樣加入到45 mL 生理鹽水中，28 ℃ 160 r/min 震蕩1 h，取上清用生理鹽水稀釋100 倍，取150 μL 稀釋液置于Biolog-ECO 平板中。28 ℃下培養(yǎng)216 h。每隔24 h 使用多功能酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）測(cè)定平板在590、750 nm 下的光密度值。每孔顏色變化所測(cè)定的吸光值反映微生物對(duì)碳源的利用情況。AWCD 的計(jì)算公式如下：

AWCD=∑［（Ci－R）590－（Ci－R）750］/n式中，Ci為測(cè)定的第i個(gè)碳源孔的光密度值；R為對(duì)照孔的光密度值；n為碳源種類數(shù)，本研究中n值隨所研究碳源種類數(shù)變化，分別為31（所有碳源）、19（只含碳的碳源）、10（含氮碳源）、2（含磷碳源）（表1）［9］。

表1 Biolog-ECO 平板的碳源分類和元素組成Table 1 Categories and element compositions of carbon source on the Biolog-ECO plates

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)培養(yǎng)120 h 的底泥樣品微生物碳源代謝的AWCD 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用SigmaPlot for Windows作圖，采用IBM SPSS 18.0 進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan 多重比較檢驗(yàn)組間差異。采用IBM SPSS 18.0 進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析，分析池塘底泥理化指標(biāo)與微生物碳源利用率的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥的氮含量分析

羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥中的TN 含量為0.38～1.43 g/kg（干重），NH4-N 含量為8.18～67.73 mg/kg（干重），NO3-N 含量為13.53～27.30 mg/kg（干重），NO2-N 含量為1.57～15.78 mg/kg（干重）。從圖1 可見(jiàn)，7 月和10 月的NH4-N 含量顯著高于4 月，4 月的NO3-N 含量顯著高于7 月和10 月，NO2-N 含量在3 個(gè)采樣時(shí)間之間無(wú)顯著性差異，10 月的TN 含量顯著高于4 月和7 月。

圖1 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥的氮含量分析Fig.1 Analysis of nitrogen contents in sediment of highdensity tilapia pond

2.2 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物對(duì)不同碳源的利用特征

本研究結(jié)果顯示，羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物的AWCD 值4 月＞10 月＞7 月（圖2），表明4 月的底泥微生物代謝活性較高。從不同類碳源的利用情況（表2）來(lái)看，4 月池塘底泥微生物對(duì)只含碳的碳源的總利用率顯著高于7 月和10月，對(duì)含氮碳源的總利用率顯著高于7 月。從單個(gè)碳源的利用情況（表2）來(lái)看，底泥微生物無(wú)法利用的碳源有2-羥基苯甲酸、衣康酸和α-丁酮酸；4 月池塘底泥微生物對(duì)D-半乳糖酸-γ-內(nèi)脂、吐溫40、吐溫80、α-環(huán)式糊精、γ-羥丁酸、苯乙胺的利用率顯著高于7 月和10 月，對(duì)4-羥基苯甲酸、L-天門冬酰胺的利用率顯著高于7 月；10 月池塘底泥微生物對(duì)L-天門冬酰胺的利用率也顯著高于7 月。

圖2 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物的AWCD 值Fig.2 AWCD value of microorganisms in sediment of high-density tilapia pond

表2 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物對(duì)不同碳源的利用情況（AWCD 值）Table 2 Utilization of different carbon source by microorganisms in sediment of high-density tilapia pond（AWCD value）

（續(xù)表2）

2.3 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥理化指標(biāo)與底泥微生物碳源利用率的相關(guān)分析

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果（圖3）顯示，羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥中的TN 含量與NH4-N含量呈正相關(guān)（r=0.73、P=0.008），NH4-N 含量與NO3-N、NO2-N 含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.88、P=0.000，r=-0.62、P=0.031），NO3-N 含量與NO2-N 含量呈正相關(guān)（r=0.62、P=0.032）。底泥微生物對(duì)含氮碳源的利用率、對(duì)只含碳的碳源的利用率與底泥中的NO3-N 含量呈正相關(guān)（r=0.68、P=0.014，r=0.63、P=0.027）；底泥微生物對(duì)含氮碳源的利用率與對(duì)含磷碳源的利用率、對(duì)只含碳的碳源的利用率呈正相關(guān)（r=0.69、P=0.013，r=0.79、P=0.002）；底泥微生物對(duì)含磷碳源的利用率與對(duì)只含碳的碳源的利用率呈正相關(guān)（r=0.71、P=0.010）。

圖3 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥理化指標(biāo)與底泥微生物碳源利用率的相關(guān)分析Fig.3 Correlation analysis of sediment physiochemical indexes and utilization rate of carbon sources by microorganisms in sediment of high-density tilapia pond

3 討論

池塘養(yǎng)殖生產(chǎn)中，飼料的投入及魚類的排泄物使底泥中的TN 逐漸積累［16］，有研究表明，池塘輸入氮總量的35%以上富集到底泥中［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，高密度羅非魚養(yǎng)殖池塘底泥中TN 和NH4-N 不斷積累，10 月份時(shí)含量最高；而3 個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)底泥的NO2-N 含量無(wú)顯著差異，可能是由于NO2-N 作為硝化過(guò)程中的中間產(chǎn)物不能穩(wěn)定存在，氧氣充足時(shí)微生物將NO2-N 轉(zhuǎn)化為對(duì)水生動(dòng)物低毒的NO3-N。4 月份底泥中的NO3-N 含量最高，是由于年初的清塘?xí)裉潦桂B(yǎng)殖初期底泥中的含氧量升高，但隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行，養(yǎng)殖中期和末期底泥中的含氧量逐漸下降，推測(cè)是由于底泥中的厭氧條件加速了反硝化作用。羅非魚池塘底泥中的NH4-N 是底泥中氮存在的主要形式［18-19］，本研究的相關(guān)分析結(jié)果顯示，羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥中的TN 含量與NH4-N 含量呈正相關(guān)。

AWCD 值可以反映微生物的代謝速率、活性等［5］。研究表明，養(yǎng)殖水體微生物對(duì)Biolog-ECO 平板中不同碳源的利用率達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間不同，AWCD 值趨于穩(wěn)定的時(shí)間在96～168 h 之間［20］。本研究的底泥微生物對(duì)碳源利用的適應(yīng)期最長(zhǎng)達(dá)到120 h，因此選擇培養(yǎng)120 h 的底泥微生物的碳源代謝AWCD 值作進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。前人研究將碳源分成氨基酸、碳水化合物、羧酸、多聚物、酚酸和胺類等不同類型［8］，本研究按照碳源的元素組成將其分為只含碳的碳源、含氮碳源、含磷碳源［9］。在利用碳源方面，底泥微生物能較好地利用β-甲基-D-葡萄糖苷、丙酮酸甲酯、D-半乳糖醛酸、吐溫80、D-甘露醇、肝糖、D-纖維二糖等只含碳的碳源和L-天門冬酰胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺（AWCD＞0.5）等含氮碳源，也可以利用D，L-α-磷酸甘油、α-D-葡萄糖-1-磷酸（AWCD＜0.5）等含磷碳源，不能利用2-羥基苯甲酸、衣康酸和α-丁酮酸（AWCD＜0.5）。研究表明，Biolog-ECO 平板中微生物可以利用的碳源或類似物往往也存在于其原來(lái)的生境［21］。本研究4 月份底泥微生物利用的碳源種類多于7月份和10 月份，說(shuō)明4 月份底泥中的有機(jī)物種類不同于7 月份和10 月份。高溶解氧條件下底泥菌群的微生物多樣性高于低氧和厭氧條件，且利用碳源的能力也更高［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，4 月份底泥微生物對(duì)只含碳的碳源的總利用率顯著高于7 月份和10 月份，可能是由于年初的清塘?xí)裉撂岣吡损B(yǎng)殖初期底泥中的含氧量，養(yǎng)殖中期和末期底泥中的含氧量下降，降低了底泥菌群的代謝能力。有研究表明，養(yǎng)殖水體微生物對(duì)Biolog-ECO 平板的含氮碳源的利用率和水體中氨氮的含量呈負(fù)相關(guān)［8］，與前人發(fā)現(xiàn)的異養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)先使用氨氮作為生長(zhǎng)源的研究結(jié)論一致［23］。本研究也發(fā)現(xiàn)，4 月份池塘底泥微生物對(duì)含氮碳源的總利用率顯著高于7 月份，而4 月份底泥中的氨氮含量顯著低于7 月份，結(jié)果驗(yàn)證了前人的研究結(jié)論。池塘環(huán)境中的氮循環(huán)主要由微生物驅(qū)動(dòng)，含氮有機(jī)物經(jīng)氨化作用形成氨，在有氧條件下氨經(jīng)硝化作用轉(zhuǎn)化成硝酸鹽，硝酸鹽經(jīng)反硝化作用轉(zhuǎn)化成N2［24］。底泥中的硝酸鹽含量越高，表示底泥微生物的硝化作用越強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，底泥微生物的含氮碳源的AWCD 值與底泥中的硝酸鹽含量呈正相關(guān)，因此可以嘗試?yán)肂iolog-ECO 平板技術(shù)分析底泥微生物的氨氮代謝功能。底泥微生物對(duì)含氮碳源的利用率與其對(duì)含磷碳源的利用率、對(duì)只含碳的碳源的利用率呈正相關(guān)；底泥微生物對(duì)含磷碳源的利用率與其對(duì)只含碳的碳源的利用率呈正相關(guān)，表明池塘底泥微生物群落結(jié)構(gòu)和功能相對(duì)穩(wěn)定。楊鶯鶯等［7］研究表明，羅非魚池塘底泥微生物群落對(duì)4 大類碳源的利用各月份間無(wú)顯著差異。宋景華等［25］應(yīng)用Biolog-ECO 平板技術(shù)分析了循環(huán)水養(yǎng)殖池塘水質(zhì)理化因子與微生物群落碳代謝特性的關(guān)系，結(jié)果顯示池塘水體TN、TP 與微生物代謝活性正相關(guān)；冗余分析結(jié)果表明TN、TP 等環(huán)境因子對(duì)養(yǎng)殖池塘微生物群落代謝的差異性貢獻(xiàn)最大。本研究結(jié)果表明，底泥微生物對(duì)含氮碳源的代謝活性與底泥中的硝酸鹽含量呈正相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究采用Biolog-ECO 平板技術(shù)研究羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物對(duì)不同碳源的代謝規(guī)律，結(jié)果表明，在養(yǎng)殖初期池塘底泥微生物對(duì)只含碳的碳源和含氮碳源的利用率高于養(yǎng)殖中期和末期，養(yǎng)殖中期和末期底泥中的總氮和氨氮含量顯著高于養(yǎng)殖初期。底泥微生物對(duì)含氮碳源的利用率與底泥中的硝酸鹽含量呈正相關(guān)，因此可以嘗試?yán)肂iolog-ECO 平板技術(shù)分析底泥微生物的氮利用指數(shù)，評(píng)估底泥菌群對(duì)氮的處理能力。