黃曉剛，韓貝貝，李 菊，張守全

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物科學(xué)繁殖實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

哺乳動(dòng)物的二倍體原始生殖細(xì)胞需要通過減數(shù)分裂和分化才能轉(zhuǎn)化成單倍體的卵母細(xì)胞或精子，這個(gè)過程稱為配子發(fā)生。雌雄配子的發(fā)生是一個(gè)多步驟的動(dòng)態(tài)過程，包括3個(gè)時(shí)期，即增殖期、生長(zhǎng)期和減數(shù)分裂期，此過程涉及錯(cuò)綜復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控，其中包括編碼基因的階段特異性表達(dá)調(diào)控以及非編碼基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。

微小RNA(microRNA，miRNA)是其中一類小的非編碼RNA，長(zhǎng)度為19～22 nt，在真核生物中廣泛表達(dá)[1]，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為70～90 nt的單鏈RNA前體經(jīng)核糖核酸內(nèi)切酶(Dicer)加工后生成，通過識(shí)別靶基因非翻譯區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致mRNA降解或者蛋白質(zhì)翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[2-3]。近年來研究顯示，miRNA參與生命過程中的一系列重要進(jìn)程，包括早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡等，它們?cè)诓溉閯?dòng)物生殖活動(dòng)中的作用也逐漸被揭示，部分研究表明，miRNA在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生、精子成熟、顆粒細(xì)胞增殖、卵母細(xì)胞成熟、卵泡發(fā)育及早期胚胎發(fā)育等過程中都發(fā)揮著重要作用[4-5]。因此，了解miRNA在這些過程中的作用機(jī)理對(duì)探究哺乳動(dòng)物生殖活動(dòng)的分子機(jī)制具有深遠(yuǎn)影響。作者主要就miRNA在哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞配子發(fā)生中的表達(dá)和潛在作用進(jìn)行綜述，以期為深入研究哺乳動(dòng)物配子發(fā)生調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 miRNA在精子發(fā)生中的作用

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括精原細(xì)胞的有絲分裂增殖、早期精母細(xì)胞的形成、單倍體圓形精子的產(chǎn)生、染色質(zhì)凝聚和核成形、多余細(xì)胞質(zhì)的去除以及頂體和精子尾部的形成[6]。這一過程不僅受階段特異性表達(dá)的編碼基因的調(diào)控，還伴隨著非編碼基因的調(diào)節(jié)，其中，miRNA以細(xì)胞特異性的形式表達(dá)，通過對(duì)其靶mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的方式在精子發(fā)生過程中發(fā)揮作用[7]。

在對(duì)哺乳動(dòng)物精子發(fā)生的早期研究中，有學(xué)者通過調(diào)節(jié)對(duì)睪丸形成和精子發(fā)生具有關(guān)鍵作用的支持細(xì)胞的功能，揭示了不同miRNA在精子發(fā)生中的潛在作用[8]。后續(xù)研究表明，Dicer是miRNA加工必不可少的RNA核酸內(nèi)切酶，若缺失會(huì)導(dǎo)致成熟的miRNA完全丟失[9]，將支持細(xì)胞中的Dicer1選擇性失活后，會(huì)導(dǎo)致生精小管內(nèi)精子喪失及生精障礙[10]，這表明miRNA在精子發(fā)生中具有重要作用。此外，Sara等[11]研究表明，miRNA表達(dá)的改變會(huì)導(dǎo)致精子異常，進(jìn)一步證明miRNA對(duì)精子發(fā)生具有不可或缺的作用。近年來，許多體內(nèi)和體外功能研究顯示某些miRNA可通過調(diào)節(jié)支持細(xì)胞、精原干細(xì)胞和精細(xì)胞的功能和狀態(tài)在精子發(fā)生的過程中發(fā)揮重要作用(表1)。

表1 miRNA在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生中的作用

1.1 miRNA對(duì)支持細(xì)胞的作用

支持細(xì)胞的功能對(duì)精子發(fā)生的順利進(jìn)行必不可少。在豬睪丸中，miR-762可以通過下調(diào)環(huán)指蛋白4(RNF4)和雄激素受體(AR)基因的表達(dá)及促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，從而促進(jìn)未成熟支持細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，進(jìn)而在精子發(fā)生中發(fā)揮作用[12]。miR-638則與miR-762相反，它通過抑制精子相關(guān)抗原1(SPAG1)基因的表達(dá)，間接滅活PI3K/Akt信號(hào)通路，從而促使豬睪丸中未成熟的支持細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]；同樣地，miR-26a在豬睪丸組織不同發(fā)育階段差異表達(dá)，可以通過靶向與精子形成有關(guān)的P21蛋白激活激酶2(PAK2)基因來抑制睪丸支持細(xì)胞的增殖并促使其凋亡，從而阻礙精子的產(chǎn)生[14]。以上研究結(jié)果表明，miRNA參與支持細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。因此，研究不同發(fā)育階段的支持細(xì)胞中miRNA的差異表達(dá)將有助于揭示精子發(fā)生早期過程的調(diào)控機(jī)制。

1.2 miRNA對(duì)精原干細(xì)胞和精細(xì)胞的作用

miRNA除了調(diào)節(jié)支持細(xì)胞的增殖和凋亡外，還參與精子發(fā)生的后續(xù)過程。其中，miR-221可能通過抑制干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(c-kit)基因的表達(dá)與miR-290家族共同維持精原干細(xì)胞的干性，從而調(diào)節(jié)精原細(xì)胞和原代精母細(xì)胞的增殖[15]；miR-203可以介導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白44(Rbm44)基因表達(dá)的抑制，從而調(diào)節(jié)精細(xì)胞的減數(shù)分裂[15]；miR-34c在生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)，并且主要在減數(shù)分裂后期表達(dá)，可通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)因子同源框2(TGIF2)和Notch受體2(Notch2)基因的表達(dá)，在精子發(fā)生過程中發(fā)揮作用[16]；miR-34家族可能與細(xì)胞周期阻滯和減數(shù)分裂進(jìn)程有關(guān)，從而在精子發(fā)生后期發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。此外，miR-15b、miR-383和miR-122也可通過改變p53、半胱天冬酶9(Caspase-9)和細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)等靶基因的表達(dá)水平，參與調(diào)節(jié)精子異常[11]。以上研究結(jié)果表明,miRNA除了通過調(diào)節(jié)支持細(xì)胞的增殖和凋亡，間接參與調(diào)控精子發(fā)生外，還可以通過調(diào)節(jié)精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及精細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，直接調(diào)控精子發(fā)生。因此，研究雄性生殖細(xì)胞中miRNA的特異性表達(dá)將有助于揭示精子發(fā)生后續(xù)過程的調(diào)控機(jī)制。

1.3 miRNA在精子附睪成熟過程中的表達(dá)

精子在睪丸中形成后，需要通過附睪以獲得運(yùn)動(dòng)能力和受精能力。選擇性敲除小鼠附睪細(xì)胞中的Dicer1基因后，會(huì)導(dǎo)致其分化失調(diào)[17]，推測(cè)miRNA在附睪發(fā)育和精子成熟中也具有調(diào)節(jié)作用。在精子通過附睪的過程中，附睪不但會(huì)以附睪小體的方式將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至精子上[18]，也會(huì)分泌不同的miRNA并且轉(zhuǎn)運(yùn)至精子上[19]，其中包括牛附睪頭含量較高的miR-145、miR-143、miR-214和miR-199，以及附睪尾含量較高的miR-654、miR-1224和miR-395[20]。在小鼠附睪中，精子具有復(fù)雜的miRNA組成，并且在精子沿附睪移動(dòng)的過程中，miRNA的組成會(huì)發(fā)生改變[21]，表明精子miRNA的組成在精子發(fā)生后是動(dòng)態(tài)的。miR-21a、miR-29c、miR-199a、miR-200b/c和miR-10a/b等miRNA在睪丸精子中含量相對(duì)較少，但在附睪的精子中會(huì)隨著精子成熟而逐漸積累[19]；miR-467e主要聚集在附睪頭部，miR-204b-5p和miR-375-3p在附睪頭和附睪體中含量較高，而miR-208b-3p、miR-196b-5p和miR-34c則在附睪尾含量較高[22]。雖然近年來已有研究表明miRNA在附睪中具有重要作用，但仍需要通過更進(jìn)一步的研究來探明miRNA在精子通過附睪的過程中是如何調(diào)節(jié)精子成熟的。

2 miRNA在卵子發(fā)生中的作用

在卵子發(fā)生的過程中，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞等卵泡內(nèi)的體細(xì)胞相互作用，促使成熟的卵母細(xì)胞通過排卵而釋放。其中，顆粒細(xì)胞通過產(chǎn)生雌二醇(E2)[23]并以縫隙連接的方式使得卵母細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞之間的雙向通訊橋交叉連接，從而參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟[24-26]。

在卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟的過程中，已通過功能性敲除Dicer1基因[27]、Argonaute蛋白2(AGO2)基因(miRNA加工機(jī)制中RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體的關(guān)鍵組成部分)[28]和核糖核酸酶(drosha)基因(負(fù)責(zé)Pri-miRNA加工的基因)[29]證明miRNA的作用。miRNA在卵母細(xì)胞的發(fā)育中也表現(xiàn)出階段特異性，如當(dāng)豬卵母細(xì)胞從生發(fā)泡(GV)期進(jìn)入第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)時(shí)，miR-486、miR-10b、miR-10a-5p、miR-183和miR-21升高，miR-210和miR-27b-3p降低[30]；牛GV和MⅡ期卵母細(xì)胞之間存在包括miR-130b在內(nèi)的幾種miRNAs的差異表達(dá)[31]，并且有30種miRNAs僅在其GV期卵母細(xì)胞中表達(dá)，包括miR-208a、miR-2317、miR-2320、miR-365-5p、miR-584、miR-628和miR-876等，有35種miRNAs僅在其MⅡ期卵母細(xì)胞中表達(dá)，包括miR-144、miR-1603、miR-190b、miR-29b、miR-29c、miR-29e、miR-412和miR-449b等[32]。近年來，許多體內(nèi)和體外功能研究顯示，某些miRNA通過調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的功能和狀態(tài)在卵子發(fā)生過程中發(fā)揮作用(表2)。

表2 miRNA在哺乳動(dòng)物卵子發(fā)生中的作用

2.1 miRNA對(duì)卵母細(xì)胞的作用

在小鼠卵母細(xì)胞成熟的過程中，miR-125a-3p自身會(huì)下調(diào)，使得蛋白酪氨酸激酶(Fyn)基因表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)生發(fā)泡破裂[33]；miR-27b則會(huì)通過靶向過氧化物酶體增殖物激活型受體γ(PPARγ)基因調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，從而影響豬卵母細(xì)胞的成熟[34]；而在牛卵母細(xì)胞發(fā)育的過程中，miR-130b通過靶向Smad家族成員5(Smad5)和絲裂原和應(yīng)激激活蛋白激酶1(MSK1)基因促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟以及卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖[35]。這些研究證明miRNA對(duì)卵母細(xì)胞成熟過程具有調(diào)節(jié)作用，但關(guān)于不同發(fā)育階段卵母細(xì)胞中miRNA表達(dá)的研究相對(duì)較少。因此，miRNA對(duì)卵母細(xì)胞成熟過程的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究來完善和豐富。

2.2 miRNA對(duì)卵丘細(xì)胞的作用

miR-21通過激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)抑制豬和小鼠卵丘細(xì)胞凋亡[36]；miR-224下調(diào)豬卵丘細(xì)胞中芳香化酶(CYP19)基因的表達(dá)，導(dǎo)致E2水平降低，并且可以通過下調(diào)卵丘細(xì)胞中的正五聚蛋白3(Ptx3)基因的表達(dá)，對(duì)卵母細(xì)胞成熟產(chǎn)生抑制作用[37]；miR-378同樣可以靶向芳香化酶調(diào)節(jié)卵巢E2的產(chǎn)生[38]，也可能會(huì)通過抑制卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞的相互作用及下調(diào)卵丘細(xì)胞中與卵泡發(fā)育相關(guān)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)和生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)基因的表達(dá)，間接影響豬和小鼠卵母細(xì)胞的成熟能力[39-40]；miR-574直接靶向卵丘細(xì)胞中的透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)基因(卵丘細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶)抑制其表達(dá)，同樣對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟產(chǎn)生抑制作用[41]；miR-375靶向骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPR2)基因影響B(tài)MP15/GDF9受體的表達(dá)水平，從而影響牛卵丘細(xì)胞的增殖和凋亡[42]，也可以通過抑制卵丘細(xì)胞中的Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS1)和孕酮受體(PGR)基因的表達(dá)，抑制牛卵母細(xì)胞的體外成熟[43]。這些發(fā)現(xiàn)顯示miRNA不但可以調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞的增殖和凋亡，還可以調(diào)節(jié)其細(xì)胞間作用。因此，研究卵丘細(xì)胞中miRNA的表達(dá)將有助于揭示卵丘細(xì)胞調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制。

2.3 miRNA對(duì)顆粒細(xì)胞的作用

miR-181a通過下調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(SIRT1)基因的表達(dá)增加轉(zhuǎn)錄因子叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族1(FOXO1)的乙?；⒋龠M(jìn)小鼠顆粒細(xì)胞凋亡[44]；miR-383通過下調(diào)與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(CyclinD1、CyclinB、CDK1、CDK2和CDK4)基因的表達(dá)，抑制小鼠顆粒細(xì)胞的增殖，從而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育[45]；miR-126-3p通過靶向并抑制結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1(TSC1)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[46]；miR-92a通過靶向Smad家族成員7(Smad7)基因同樣起到抑制豬顆粒細(xì)胞凋亡的作用[47]；miR-1275通過靶向并下調(diào)肝受體同源物1(LRH-1)基因的表達(dá)，阻斷肝受體同源物1/腦內(nèi)細(xì)胞色素P450芳香酶(LRH-1/CYP19A1)軸，促使豬顆粒細(xì)胞凋亡并抑制E2合成[48]；miR-21-3p通過PI3K/Akt信號(hào)通路下調(diào)靶標(biāo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)基因的表達(dá)，從而抑制牛顆粒細(xì)胞自噬[49]；miR-183/96/182簇通過協(xié)同靶向FOXO1基因，促進(jìn)牛顆粒細(xì)胞的增殖，從而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育[50]；miR-17/92簇通過共調(diào)節(jié)第10號(hào)染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)和BMPR2基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)牛顆粒細(xì)胞的增殖和分化[51]；miR-424/503簇通過激活素信號(hào)通路靶向Smad7基因來調(diào)節(jié)牛顆粒細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而影響卵母細(xì)胞發(fā)育[52]；miR-31/143通過靶向促卵泡素受體(FSHR)基因調(diào)節(jié)類固醇激素的合成，并影響牛顆粒細(xì)胞的凋亡[53]；miR-125b通過靶向骨形成蛋白Ⅰ型受體B(BMPR1B)基因調(diào)節(jié)牦牛顆粒細(xì)胞的凋亡[54]。這些發(fā)現(xiàn)顯示miRNA參與調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，而顆粒細(xì)胞通過產(chǎn)生E2和縫隙連接的方式參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟，研究顆粒細(xì)胞中miRNA的表達(dá)及其對(duì)激素合成和縫隙連接的作用有助于更進(jìn)一步揭示顆粒細(xì)胞調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟的分子機(jī)制。

4 小 結(jié)

miRNA在哺乳動(dòng)物配子發(fā)生到配子成熟的過程中具有重要的調(diào)控作用。在精子發(fā)生的過程中，miRNA會(huì)以細(xì)胞特異性的形式在支持細(xì)胞、精原干細(xì)胞和精細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮調(diào)控作用；在卵母細(xì)胞成熟的過程中，miRNA除了對(duì)卵母細(xì)胞直接發(fā)揮調(diào)控作用外，還會(huì)影響卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖及激素合成，從而間接參與調(diào)控卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟。此外，前人的研究結(jié)果也已證明，miRNA由于序列較短，在哺乳動(dòng)物中結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，未來很有可能成為判斷哺乳動(dòng)物繁殖能力的分子標(biāo)記。但是，大部分miRNA的功能尚未明確，其中包括miRNA與miRNA之間的互作調(diào)控關(guān)系以及miRNA在時(shí)空差異表達(dá)上的自身調(diào)控機(jī)制等。近年來有研究表明，環(huán)狀RNA(circRNA)可以作為miRNA的海綿，調(diào)控miRNA的活性[55]。 因此，在研究miRNA對(duì)靶基因作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，探究circRNA對(duì)miRNA的調(diào)控作用，將有助于更深入地揭示miRNA的具體作用機(jī)制及其自身的調(diào)控方式。