常樹勛,王寶婷,孫艷軍

(焦作市人民醫(yī)院肛腸科，河南 焦作454000)

肛腸疾病是影響人類健康的主要慢性病之一，我國成年人的肛腸病患病率達50%以上[1]，主要癥狀有肛內(nèi)腫物脫出、肛門墜脹感、肛門周圍疼痛、便血等。長期便血可導致失血性貧血、感染等并發(fā)癥，且痔易脫垂、嵌頓[2]，影響患者健康。手術(shù)是治療肛腸疾病的常用方式，但肛腸手術(shù)多為開放式，且位置特殊，易造成術(shù)后感染，影響術(shù)后恢復[3]。因此，肛腸術(shù)后用藥物促進創(chuàng)面愈合尤為必要。臨床研究顯示，在肛腸術(shù)后采用中藥治療可鎮(zhèn)痛，消腫，減少炎性分泌物，促進傷口愈合，提高患者生活質(zhì)量[4-5]。對于肛腸疾病術(shù)后患者，使用中藥洗劑可收到殺菌抗炎、消腫止痛的效果，可促進創(chuàng)面愈合。苦柏顆粒洗劑以苦參、黃柏為主要原料，有清熱涼血、燥濕解毒、活血止血、止癢止痛的功效。研究[6]表明，苦柏顆粒具有抑制炎癥、改善皮膚屏障功能的作用。目前雖有苦柏顆粒用于皮膚創(chuàng)面的相關(guān)研究，但用于肛腸術(shù)后者較少。本研究通過建立大鼠肛腸術(shù)后模型，觀察苦柏顆粒洗劑對大鼠肛腸術(shù)后創(chuàng)面的愈合作用和對炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物

無特定病原體(SPF)級SD大鼠50只，雌雄各半，7周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自河南省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證編號為SCXK(豫)2017-0001，飼養(yǎng)于焦作福瑞堂制藥有限公司，使用許可證編號為SYXK(豫)2020-0005。飼養(yǎng)環(huán)境是12 h/12 h光照黑暗循環(huán)，溫度18～26 ℃，濕度40%～70%，適應性飼喂7 d。實驗過程遵循3R原則。

1.2 藥品、試劑與儀器

苦柏顆粒洗劑藥物組成：苦參10 g，黃柏6 g，蒲公英5 g，紫花地丁5 g，馬齒莧5 g，明礬2 g，艾葉2 g，防風3 g，芒硝3 g，三棱5 g，甘草片3 g，莪術(shù)5 g，紅花6 g?？喟仡w粒洗劑由焦作市人民醫(yī)院制劑室自制，使用前將上述60 g藥物倒入100 mL沸水中制成苦柏顆粒洗劑，用溫度計測量，冷卻至38～42 ℃時進行涂抹。馬應龍麝香痔瘡膏，武漢馬應龍藥業(yè)集團股份有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號170209，20 g/支。大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6和IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒,均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，批號依次為SEKR-0009、SEKR-0005、SEKR-0006；兔抗大鼠p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)抗體、核因子κB(NF-κB)抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，均為英國艾博抗公司產(chǎn)品，批號依次為ab207483、ab220803、ab150077。EM UC7切片機，德國徠卡公司產(chǎn)品；CX43顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；PHomo酶標儀，奧地利安圖斯公司產(chǎn)品等。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

適應性飼養(yǎng)1周后，隨機選取10只為正常組，剩余40只根據(jù)參考文獻[7]建立肛腸術(shù)后模型。造模前1 d禁食，當日禁水，每只大鼠按照2.5 μL/g腹腔注射質(zhì)量分數(shù)20 g/L戊巴比妥鈉麻醉，將其仰臥固定于實驗臺；用質(zhì)量分數(shù)80 g/L硫化鈉在大鼠肛周及鼠尾近端脫毛，消毒；待肛門松弛后，以肛緣為界，將皮膚切至黏膜下層，切口修剪為三角形(底寬約1 cm，高約2 cm)，深至皮下深筋膜層。手術(shù)1 d，出現(xiàn)肛周急性炎癥并伴有充血、腫脹、滲液即為造模成功。本實驗中，40只大鼠均造模成功。將40只模型大鼠隨機分為模型組、馬應龍痔瘡膏組、苦柏顆粒洗劑隔日1次組、苦柏顆粒洗劑1 d 2次組，每組10只。造模成功后24 h開始治療，馬應龍痔瘡膏組使用馬應龍痔瘡膏于肛門創(chuàng)面均勻涂抹薄薄一層，1 d 2次；苦柏顆粒洗劑隔日1次組使用苦柏顆粒洗劑連續(xù)3次涂抹肛門創(chuàng)面，自然晾干，隔日涂抹1次；苦柏顆粒洗劑1 d 2次組使用苦柏顆粒洗劑連續(xù)3次涂抹肛門創(chuàng)面，自然晾干，1 d 2次。治療時間為10 d。

1.4 檢測指標

于給藥第1、5、10天對大鼠術(shù)后創(chuàng)面進行癥狀評分，并于末次評分后采用頸椎脫臼法處死大鼠，取肛周組織。

1.4.1 創(chuàng)面局部癥狀評分

創(chuàng)面局部癥狀評分標準：肛周表面無創(chuàng)傷，計0分；創(chuàng)面完全愈合，無紅腫，計1分；創(chuàng)面基本愈合，創(chuàng)面紅腫不明顯，計2分；創(chuàng)面未愈合，有紅腫，偶有滲液，計3分；創(chuàng)面未愈合，紅腫較為嚴重，滲液較多，計4分。分值越高表示創(chuàng)面愈合程度越低。

1.4.2 創(chuàng)面黏膜的組織病理學形態(tài)

取大鼠肛周創(chuàng)面組織，以體積分數(shù)為100 mL/L甲醛固定，石蠟包埋后切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脫蠟5 min，梯度濃度乙醇脫水，蘇木精-伊紅(HE)染色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察組織病理學形態(tài)。

1.4.3 肛周組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平

采用ELISA法按照試劑盒說明書進行操作。取大鼠肛周組織剪碎，研磨，酶標板上加入預包被特異性抗體，37 ℃溫育30 min，棄去上層液體，加入酶標制劑50 μL，37 ℃溫育30 min，洗滌，加入50 μL顯色劑A，后加入50 μL顯色劑B，震蕩混勻后，37 ℃避光顯色15 min，加入終止液50 μL，于450 nm波長處酶標儀讀數(shù)吸光度值(A)，根據(jù)標準曲線，計算TNF-α、IL-6及IL-10水平。

1.4.4 肛周組織p38MAPK、NF-κB蛋白表達情況

采用Western blot檢測。取-80 ℃保存的大鼠肛周組織，加入RIPA裂解液裂解細胞，收集到離心管，離心后取上層清液，用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。取適量裂解產(chǎn)物，上樣，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束之后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜中，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入I抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，洗滌，加入相應的II抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，洗滌，加入電化學發(fā)光反應液孵育3 min，于暗盒中曝光，顯影沖洗，測定蛋白條帶的積分光密度值。以GAPDH為內(nèi)參，p38MAPK、NF-κB與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值為目的蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠術(shù)后創(chuàng)面局部癥狀評分對比

術(shù)后第5、10天，創(chuàng)面局部癥狀評分組間對比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組對比，3個藥物組第5、10天術(shù)后創(chuàng)面局部癥狀評分均降低(P<0.05)。與馬應龍痔瘡膏組對比，2個苦柏顆粒洗劑組第5、10天術(shù)后創(chuàng)面局部癥狀評分均升高(P<0.05)。與苦柏顆粒洗劑隔日1次組對比，苦柏顆粒洗劑1 d 2次組第5、10天術(shù)后創(chuàng)面局部癥狀評分降低(P<0.05)。4組的術(shù)后創(chuàng)面局部癥狀評分均隨時間延長而降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后創(chuàng)面局部癥狀評分對比 分，

2.2 各組大鼠肛周創(chuàng)面組織病理學形態(tài)對比

正常組：黏膜上皮組織排列整齊，無任何病理變化。模型組：黏膜上皮組織缺失嚴重，有明顯腺體缺失現(xiàn)象，水腫和充血嚴重，大量炎性細胞浸潤。馬應龍痔瘡膏組：肛周黏膜上皮組織排列整齊緊密，結(jié)構(gòu)較為完整，有輕度紅腫，無明顯充血?？喟仡w粒洗劑隔日1次組：黏膜上皮組織和腺體缺失，水腫、充血，有少量炎性細胞浸潤?？喟仡w粒洗劑1 d 2次組：病理變化較苦柏顆粒洗劑隔日1次組病變減輕，黏膜上皮較為完整，偶有腺體缺失，黏膜下層水腫和充血程度較輕。見圖1。

A.正常組:肛周創(chuàng)面組織未見病理改變。B.模型組：肛周黏膜上皮組織缺失嚴重，發(fā)生明顯水腫和充血，大量炎性細胞浸潤。C.馬應龍痔瘡膏組:肛周黏膜上皮組織輕度紅腫，無明顯充血。D.苦柏顆粒洗劑隔日1次組：組肛周黏膜上皮組織少量缺失，存在水腫和充血，少量炎性細胞浸潤。E.苦柏顆粒洗劑1 d 2次組：肛周黏膜上皮較完整，偶有腺體缺失，水腫、充血及炎性細胞浸潤較少。圖1 各組大鼠術(shù)后創(chuàng)面病理圖(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠肛周組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平對比

大鼠肛周組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平組間對比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與正常組對比，模型組和3個藥物組肛周組織中TNF-α、IL-6水平均升高，IL-10水平均降低(P<0.05)。與模型組對比，3個藥物組肛周組織中TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)。與馬應龍痔瘡膏組對比，2個苦柏顆粒洗劑組肛周組織中TNF-α、IL-6水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)。與苦柏顆粒洗劑隔日1次組對比，苦柏顆粒洗劑1 d 2次組肛周組織中TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肛周組織中TNF-α、IL-6和 IL-10水平對比

2.4 各組大鼠肛周組織中p38MAPK和 NF-κB蛋白表達水平對比

大鼠肛周組織p38MAPK和NF-κB蛋白相對表達水平組間對比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與正常組對比，模型組和3個藥物組肛周組織p38MAPK和NF-κB蛋白相對表達水平均升高(P<0.05)；與模型組對比，3個藥物組肛周組織p38MAPK和NF-κB蛋白相對表達水平均降低(P<0.05)。與馬應龍痔瘡膏組對比，2個苦柏顆粒洗劑組肛周組織p38MAPK和NF-κB蛋白相對表達水平均升高(P<0.05)。與苦柏顆粒洗劑隔日1次組對比，苦柏顆粒洗劑1 d 2次組肛周組織p38MAPK和NF-κB蛋白相對表達水平降低(P<0.05)。見表3和圖2。

表3 各組大鼠肛周組織中p38MAPK和 NF-κB蛋白表達水平對比

A.正常組;B.模型組;C.馬應龍痔瘡膏組；D.苦柏顆粒洗劑隔日1次組；E.苦柏顆粒洗劑1 d 2次組圖2 各組大鼠肛周組織p38MAPK和NF-κB蛋白相對表達水平對比(Western blot法)

3 討 論

肛腸疾病的發(fā)病部位為大腸和肛門，臨床上以痔瘡、肛裂、肛瘺、肛周膿腫最為常見。手術(shù)治療后，肛周術(shù)后創(chuàng)面可刺激炎性因子產(chǎn)生，提高機體疼痛敏感性，導致肛腸疾病患者術(shù)后出現(xiàn)急慢性疼痛[8]。排便，手術(shù)對肛門、直腸及鄰近組織的牽拉、擠壓和損傷，以及腸道內(nèi)細菌感染易造成創(chuàng)面炎癥而影響術(shù)后恢復。外用藥物是臨床常見的促進肛腸術(shù)后創(chuàng)面愈合的方法，可以阻隔創(chuàng)面與腸道細菌的接觸，降低肛周創(chuàng)面的敏感性，縮短愈合時間。

中醫(yī)學認為，飲食不節(jié)、風濕燥熱、情志失調(diào)、氣血不和、腹臟虛弱、氣血虧虛等是引起肛腸疾病的因素，其中以風、濕、燥、熱四邪尤為突出，故肛腸疾病術(shù)后應配合清熱解毒、燥濕涼血的藥物進行治療?？喟仡w粒洗劑中，苦參可祛濕瀉熱，止癢，殺蟲[9]；黃柏可瀉火解毒[10]；蒲公英清熱解毒，利尿散結(jié)；地丁可抗菌消炎、消腫止痛[11]；馬齒莧可散血消瘀[12]；明礬可收濕斂瘡[13]；艾葉可祛濕止血[14]；防風可解毒消腫；芒硝可瀉下通便[15]；三棱和莪術(shù)可清除瘀滯，清利濕熱；紅花可活血化瘀，理氣止痛；甘草片可調(diào)和藥物，緩和瀉下作用。諸藥共用，發(fā)揮祛濕消腫、活血行氣、清熱止痛等作用。李舜等[16]研究表明，苦參和黃柏提取物有一定的消炎、抑菌作用。本研究中，局部癥狀評分結(jié)果顯示：模型組和各藥物組的癥狀評分隨時間延長而降低，苦柏顆粒洗劑兩個組癥狀評分低于模型組。HE染色顯示：模型組黏膜上皮缺失嚴重，有明顯腺體缺失現(xiàn)象，伴隨嚴重的水腫和充血；苦柏顆粒洗劑2個藥物組較模型組組織病理學變化輕，且苦柏顆粒洗劑1 d 2次組優(yōu)于苦柏顆粒洗劑隔日1次組。此外，各藥物組肛周組織中的促炎因子TNF-α、IL-6水平較模型組下降，抑炎因子IL-10水平明顯升高。以上結(jié)果均提示，苦柏顆粒洗劑可減輕肛腸術(shù)后炎癥反應，改善肛周創(chuàng)面組織病理學形態(tài)。肛腸術(shù)后造成的創(chuàng)面病理基礎(chǔ)是血瘀和濕熱，使用苦柏顆粒洗劑在充分清潔創(chuàng)面的同時，還可發(fā)揮消炎、促愈等功效，促進肛周局部毛細血管擴張，使藥物有效成分通過創(chuàng)面表面作用于患處，從而減少炎性滲出物分泌，緩解水腫，促進創(chuàng)面愈合。

肛周術(shù)后炎癥機制與復雜的網(wǎng)絡轉(zhuǎn)導有著不可分割的聯(lián)系，其中NF-κB和p38MAPK與炎癥反應密切相關(guān)[17]。p38MAPK通路在炎癥反應中起著調(diào)控作用。當炎癥發(fā)生時，促炎細胞因子可以激活p38MAPK，并延長其活化時間；當p38MAPK過度抑制或激活時，可致傷口的瘢痕形成或愈合延遲[18]。NF-κB信號通路在TNF-α等促炎因子作用下，可參與IL相關(guān)基因的表達，阻斷細胞凋亡，調(diào)控炎癥反應的消退。炎癥發(fā)生時，細胞質(zhì)內(nèi)的NF-κB復合物進入細胞核，誘導炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達[19-20]。NF-κB可刺激TNF-α等細胞因子的表達，而這些細胞因子又可以刺激NF-κB，進一步活化NF-κB，造成持續(xù)或放大炎癥反應[21]。研究[22-23]證實，p38MAPK和NF-κB的活化可介導炎癥反應的發(fā)生。本研究中，肛腸術(shù)后，3個藥物組和模型組的TNF-α和IL-6的水平逐漸上升，IL-10的水平下降，p38MAPK和NF-κB的表達逐漸上升，提示苦柏顆粒洗劑能改善肛腸術(shù)后癥狀和病理變化，減輕炎癥反應，其機制可能與抑制p38MAPK/NF-κB通路的激活有關(guān)。

綜上所述，苦柏顆粒洗劑可以改善肛腸術(shù)后創(chuàng)面肛周局部癥狀和組織病理變化，減輕炎癥因子水平，其機制可能與抑制p38MAPK/NF-κB通路有關(guān)。