蔣麗元,史瑩?dān)L,葉恬恬

（1.杭州市中醫(yī)院,杭州 310007；2.杭州市丁橋醫(yī)院,杭州 310022；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053）

梅尼埃?。╩eniere's disease, MD）是耳源性眩暈病中的常見疾病[1],其病理基礎(chǔ)是內(nèi)淋巴積水（endolymphatic hydrops, EH）[2]。研究普遍認(rèn)為 MD發(fā)病機制與血漿血管加壓素（arginine vasopressin,AVP）水平的病理性升高有關(guān)[3]。動物實驗表明,經(jīng)AVP誘導(dǎo)產(chǎn)生的EH主要是通過調(diào)節(jié)AVP-cAMP-AQP2信號通路實現(xiàn)的[4]。MD目前缺乏有效治療方案。國內(nèi)臨床報道顯示電針在改善MD患者眩暈、耳鳴、聽力下降、耳悶方面效果顯著[5-6]。前期實驗發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)能顯著降低模型豚鼠的EH,改善耳蝸聽覺[7],但當(dāng)前研究尚未能對電針治療MD的最佳頻率產(chǎn)生統(tǒng)一認(rèn)識,不同頻率電針對MD的療效及其具體作用機制如何,都是亟待解決的問題。本研究采用臨床上較為常用的低頻、高頻電針研究其對 EH模型豚鼠耳蝸積水程度及螺旋神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)的影響,旨在探索電針促進EH恢復(fù)的優(yōu)選頻率,并從cAMP、AQP2角度分析其關(guān)鍵機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性白毛紅目豚鼠共 65只,體質(zhì)量350 g左右,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供[SYXK（浙）2013-0184]。豚鼠均飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心,實驗室溫度 20 ℃～25 ℃,相對濕度40%～65%,每日光照12 h,豚鼠自由攝食、飲水。實驗前豚鼠在同等標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗中對動物的處理符合科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑

醋酸去氨加壓素（1-deamino-8-D-arginine vasopressin, DDAVP）（海南中和制藥股份有限公司生產(chǎn),貨號 20170701）；環(huán)磷酸腺苷酶聯(lián)免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn),貨號 JL12116）；水通道蛋白2 ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn),貨號JL21011）。

1.3 分組與模型制備

65只豚鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、針刺組、2 Hz電針組、100 Hz電針組,共 5組,每組13只（8只用于耳蝸HE染色病理形態(tài)觀察,5只用于透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察）?？瞻捉M豚鼠不予處理,其余各組豚鼠采用腹腔注射醋酸去氨加壓素建立EH模型[8]。先按4 μg/kg給予腹腔注射,連續(xù)注射7 d后將劑量增大為 6 μg/kg,連續(xù)注射3 d,共10 d。模型評價以耳蝸HE染色病理形態(tài)觀察為準(zhǔn)[9]。

1.4 干預(yù)方法

空白組不干預(yù),僅常規(guī)飼養(yǎng)。模型組實驗時僅將豚鼠進行固定。各電針組于造模結(jié)束后進行干預(yù),針刺百會穴及左側(cè)聽宮穴,百會穴定位在兩耳連線與頭頂正中線交點,聽宮穴定位在側(cè)面耳屏正前方凹陷處[10]。實驗時,固定豚鼠,用0.18 mm×13 mm毫針平刺百會穴,進針深度 2 mm,正刺左側(cè)聽宮穴,進針深度 3 mm,連接HANS-100A型鎮(zhèn)痛電針儀。電流輸出強度為1 mA,頻率分別為2 Hz和100 Hz,電針20 min,每日1次,連續(xù)干預(yù)10 d。針刺組將毫針直接刺入百會穴和左側(cè)聽宮穴,除不接電針外,其余按照與電針組相同的操作方法和時間干預(yù)處理。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 一般情況比較

比較豚鼠精神狀態(tài)、身型、毛發(fā)、步態(tài)、自主活動情況、耳廓反應(yīng)等。

1.5.2 血漿cAMP、AQP2濃度檢測

干預(yù)結(jié)束后麻醉動物,心臟取血,離心得到血漿。采用ELISA法檢測血漿cAMP、AQP2濃度。

1.5.3 耳蝸積水程度觀察

豚鼠取血后,以 4%多聚甲醛溶液灌注至豚鼠頸項強直、四肢僵硬后,斷頭,快速取出左側(cè)聽泡并打開,取出顳骨,將顳骨標(biāo)本置于 4%多聚甲醛固定液中,固定過夜后將標(biāo)本置于 10%乙二胺四乙酸溶液脫鈣至針刺無阻力,梯度乙醇溶液脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。沿耳蝸蝸軸中央平面切片,每片厚約4.5 μm,行HE染色,光鏡下觀察并拍片。

1.5.4 中階面積/（中階面積＋前庭階面積）變化

通過前庭膜隆起程度,并計算中階面積/（中階面積＋前庭階面積）變化評估耳蝸積水程度[5]。正常情況下,耳蝸前庭膜平直,與基底膜約呈45°角（見圖1a）。前庭膜將基底膜以上的空間分為兩部分,即前庭階和中階。當(dāng)內(nèi)淋巴液增加時,前庭膜向前庭階方向聚攏,前庭膜隆起（見圖 1b）,即表示發(fā)生 EH。運用 Image ProPlus 6.0系統(tǒng)測量中軸一側(cè)第二轉(zhuǎn)中階、前庭階面積,計算中階面積/（中階面積＋前庭階面積）占比。

1.5.5 耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)觀察

豚鼠麻醉后（方法同前）,快速取出左側(cè)聽泡,用1 mL注射器吸取預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液灌流。將標(biāo)本在4 ℃冰箱固定2 d后,經(jīng)超薄切片機半薄切片,鉆石刀超薄切片,染色,用 H-7650透射電鏡觀察耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)并拍攝照片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。若方差齊則組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組豚鼠一般情況比較

模型組豚鼠精神狀態(tài)較空白組顯著下降,自主活動降低,常群聚蜷縮,對外界聲音不靈敏,飲食減少,體質(zhì)量增加緩慢,毛發(fā)蓬亂不柔順,發(fā)黃,曾出現(xiàn)過自發(fā)性眼震,時間無規(guī)律。各治療組豚鼠精神狀況、皮毛光亮程度、飲食、體質(zhì)量、自發(fā)活動、自發(fā)眼震情況與模型組比較無差別,但耳廓反應(yīng)靈敏度與模型組比較,均有所改善。

2.2 5組豚鼠耳蝸形態(tài)觀察

空白組豚鼠均未出現(xiàn) EH,前庭階、鼓階、蝸管結(jié)構(gòu)無異常；經(jīng)醋酸去氨加壓素處理后,模型組出現(xiàn) EH,表現(xiàn)為前庭膜向前庭階方向隆起擴張；針刺組、2 Hz電針組、100 Hz電針組前庭膜隆起病理情況均較模型組不同程度改善；100 Hz電針組前庭膜隆起程度較2 Hz電針組、針刺組減輕,2 Hz電針組、針刺組前庭膜隆起程度無明顯差異。詳見圖1。

圖1 耳蝸形態(tài)組織病理學(xué)觀察(HE染色,×50)

2.3 5組豚鼠中階面積/(中階面積＋前庭階面積)占比比較

與空白組比較,模型組豚鼠耳蝸中階面積/（中階面積＋前庭階面積）占比升高（P＜0.01）；與模型組比較,各治療組豚鼠耳蝸中階面積/（中階面積＋前庭階面積）占比均降低（均P＜0.01）；與針刺組比較,100 Hz電針組中階面積/（中階面積＋前庭階面積）占比降低（P＜0.05）,2 Hz電針組中階面積/（中階面積＋前庭階面積）占比與針刺組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與2 Hz電針組比較,100 Hz電針組中階面積/（中階面積＋前庭階面積）占比降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 耳蝸中階面積/(中階面積＋前庭階面積)占比比較(±s)

表1 耳蝸中階面積/(中階面積＋前庭階面積)占比比較(±s)

注:與空白組比較 1）P＜0.01；與模型組比較 2）P＜0.01；與針刺組比較 3）P＜0.05；與 2 Hz 電針組比較 4）P＜0.05

組別 n 中階面積/（中階面積＋前庭階面積）占比空白組 8 0.29±0.04模型組 8 0.49±0.061）針刺組 8 0.38±0.032）2 Hz 電針組 8 0.37±0.062）100 Hz 電針組 8 0.31±0.062）3）4）

2.4 5組豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)觀察

空白組豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)髓鞘完整,細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)整體良好,線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)清晰,呈卵圓形,無腫脹溶解,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均勻分布。模型組螺旋神經(jīng)節(jié)髓鞘嚴(yán)重松解,細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)散亂,線粒體數(shù)量減少,內(nèi)嵴腫脹斷裂,呈空泡狀,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒。經(jīng)干預(yù)后,各治療組螺旋神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)得到改善,髓鞘小部分松解,線粒體數(shù)目與空白組基本無異,內(nèi)嵴可見,少部分嵴斷裂,腫脹程度下降,可見部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),其中100 Hz電針組改善更明顯。詳見圖2。

圖2 各組豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)變化(甲苯胺藍與醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色,×4 000)

2.5 5組豚鼠血漿cAMP濃度比較

與空白組比較,模型組血漿 cAMP濃度升高（P＜0.01）；與模型組比較,各治療組豚鼠血漿cAMP濃度均降低（P＜0.05）；與針刺組比較,100 Hz電針組血漿cAMP濃度降低（P＜0.01）；與2 Hz電針組比較,100 Hz電針組豚鼠血漿cAMP濃度降低（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組豚鼠血漿cAMP濃度比較 (±s)

表2 各組豚鼠血漿cAMP濃度比較 (±s)

注:與空白組比較 1）P＜0.01；與模型組比較 2）P＜0.05,3）P＜0.01；與針刺組比較 4）P＜0.01；與 2 Hz 電針組比較 5）P＜0.01

組別 n cAMP 濃度（nmol/L）空白組 8 19.56±0.75模型組 8 24.50±1.161）針刺組 8 23.13±1.332）2 Hz 電針組 8 22.48±1.333）100 Hz 電針組 8 20.98±0.553）4）5）

2.6 5組豚鼠血漿AQP2濃度比較

與空白組比較,模型組豚鼠血漿 AQP2濃度升高（P＜0.01）；與模型組比較,各治療組豚鼠血漿AQP2濃度降低（P＜0.05）；與針刺組比較,100 Hz電針組血漿AQP2濃度降低（P＜0.05）,2 Hz電針組血漿AQP2濃度與針刺組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與 2 Hz電針組比較,100 Hz電針組血漿AQP2濃度降低 （P＜0.01）。詳見表3。

表3 各組豚鼠血漿AQP2濃度比較 (±s)

表3 各組豚鼠血漿AQP2濃度比較 (±s)

注:與空白組比較 1）P＜0.01；與模型組比較 2）P＜0.05,3）P＜0.01；與針刺組比較 4）P＜0.05；與 2 Hz 電針組比較 5）P＜0.01

組別 n AQP2 濃度（pg/ml）空白組 8 488.59±15.41模型組 8 637.50±41.441）針刺組 8 590.95±42.122）2 Hz 電針組 8 596.01±49.572）100 Hz 電針組 8 542.03±30.093）4）5）

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)梅尼埃?。╩eniere's disease, MD）患者的內(nèi)淋巴積液分級可以用來預(yù)測梅尼埃病患病嚴(yán)重程度[11],但耳蝸結(jié)構(gòu)精細(xì)復(fù)雜,通過該技術(shù)在體觀察實驗動物耳蝸積水程度仍未得到廣泛應(yīng)用。本實驗繼續(xù)采用離體研究方法觀察耳蝸前庭膜隆起程度以評估內(nèi)耳膜迷路積水程度,進一步比較治療對MD病理形態(tài)的改善作用。

臨床研究表明,MD患者在眩暈急性發(fā)作前后1周（急性期）伴有血漿血管加壓素（arginine vasopressin, AVP）水平的升高[3]。之后的研究證實AVP-cAMP-AQP2信號通路中AVP下游的各個作用因素在內(nèi)耳中均存在,使 AVP在內(nèi)耳水液代謝及內(nèi)淋巴積水（endolymphatic hydrops, EH）發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸得到關(guān)注[12]。目前研究普遍認(rèn)為AVP誘導(dǎo)產(chǎn)生的EH主要是通過調(diào)節(jié) AVP-cAMP-AQP2信號通路實現(xiàn)的[4]。研究者通過背皮下植入膠囊微量滲透壓泵及腹腔注射給入AVP的方法誘導(dǎo)豚鼠EH模型,病理切片檢測提示模型成功率為 100%[9,13]。TAKEDA T等[13]從建立的 EH模型中觀察到,模型動物血漿AVP濃度與臨床MD患者發(fā)作急性期血漿AVP濃度一致。經(jīng)AVP處理復(fù)制的EH模型考慮到了臨床中誘發(fā)MD發(fā)作的危險因素,既可誘導(dǎo)EH病理結(jié)果的發(fā)生,又能較好地模擬人類MD的病理因素及發(fā)病過程,模型也更與MD臨床特點相貼近。本實驗根據(jù)文獻,采用腹腔注射給入AVP的方法造模,評價電針對EH的干預(yù)效應(yīng)；同時通過觀察AVP下游因子cAMP及 AQP2的表達變化,有利于闡述電針對內(nèi)耳 EH的干預(yù)機制。研究發(fā)現(xiàn)模型組豚鼠耳蝸均出現(xiàn) EH,電子顯微鏡下表現(xiàn)為前庭膜向前庭階方向不同程度隆起,計算中階面積/（中階面積＋前庭階面積）占比高于空白組,與課題組前期研究結(jié)果相符[14-15],同時經(jīng) AVP誘導(dǎo)的EH模型豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生損害,并使血漿cAMP、AQP2濃度升高,與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

腦功能成像研究提示耳部疾病會促使相關(guān)大腦區(qū)域的神經(jīng)元代謝異常。如薛偉等[16]的研究表明,耳鳴患者腦橋、丘腦、顳上回、邊緣系統(tǒng)、皮層等腦功能區(qū)域連接異常。另有研究[17]發(fā)現(xiàn),MD發(fā)作期與間歇期患者均存在靜息態(tài)雙側(cè)海馬區(qū)域功能連接差異。針刺穴位可通過激活或調(diào)整有功能連接的多個靶腦區(qū)發(fā)揮治療作用。電針刺激方法的特點是參數(shù)可控、明確且穩(wěn)定,并能代替人做長時間的持續(xù)運針,是常用的針灸療法之一。關(guān)于電針的相關(guān)研究,課題組已經(jīng)積累了較多的實踐經(jīng)驗。前期的實驗研究已證實電針百會、聽宮穴能改善EH模型豚鼠的耳蝸積水程度,且優(yōu)于針刺、艾灸療法[7]。作為前期工作的延伸,本實驗進一步觀察電針干預(yù)EH的量效關(guān)系及其具體機制。電針頻率是影響針刺療效的關(guān)鍵。電針鎮(zhèn)痛的相關(guān)研究提示,使用不同頻率電針刺激相同腧穴,可選擇性地激活大腦皮層,發(fā)揮特定作用[18]。另有研究表明,低頻（2 Hz）電針對坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理痛早期（造模后 3 d）鎮(zhèn)痛效果最明顯,而高頻（100 Hz）電針對完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的慢性炎性痛早期（造模后 3 d）鎮(zhèn)痛效果最明顯[19]。在慢性傳輸型便秘的研究中發(fā)現(xiàn),高頻（100 Hz）電針刺激對改善慢性傳輸型大鼠的結(jié)腸傳輸功能優(yōu)于低頻（2 Hz）電針刺激[20]。王穎等[21]研究表明,運用不同頻率電針治療能提高阿爾茨海默病模型大鼠的記憶能力,且高頻（50 Hz）電針治療效果勝于低頻（2 Hz、30 Hz）電針。但目前尚未有文獻解釋治療 MD的更佳電針頻率。本次實驗研究中,采用高頻（100 Hz）及低頻（2 Hz）電針干預(yù)EH模型豚鼠以探究結(jié)論。結(jié)果顯示,采用2 Hz、100 Hz電針以每日1次的頻次治療耳蝸積水,均獲得良好效果；且與低頻（2 Hz）電針比較,高頻（100 Hz）電針療效更佳。

耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)位于耳蝸蝸螺旋小管內(nèi),是內(nèi)耳中離子與水通道蛋白代謝活躍的部位之一[22-23]。研究表明,DDAVP可引起水液代謝相關(guān)蛋白如上皮細(xì)胞鈉離子通道蛋白在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)表達增加[24],使內(nèi)耳水液代謝發(fā)生變化。本實驗研究結(jié)果顯示,經(jīng)AVP誘導(dǎo)的EH模型螺旋神經(jīng)節(jié)髓鞘嚴(yán)重松解,線粒體數(shù)量明顯減少,線粒體腫脹、內(nèi)嵴斷裂,呈空泡狀。電針及針刺干預(yù)使螺旋神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)得到改善,髓鞘小部分松解,線粒體腫脹程度減輕,其中100 Hz電針組改善更明顯。既往的研究證實,電針刺激穴位可使組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)得到改善,降低線粒體腫脹程度、空泡化及細(xì)胞排列不規(guī)則程度,電針具有保護線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用,改善線粒體結(jié)構(gòu)及功能的破壞,提供能量代謝水平[25],與本研究結(jié)果相符合。

近年來,AVP-cAMP-AQP2信號通路與EH發(fā)生機制的研究不斷深入。研究發(fā)現(xiàn) cAMP參與介導(dǎo)了以 AVP為觸發(fā)點途徑的AQP2表達改變及水液代謝過程。腺苷酸環(huán)化酶是cAMP信號通路中的重要一環(huán),研究發(fā)現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶主要在與內(nèi)淋巴液循環(huán)密切相關(guān)的部位（如血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)、纖維細(xì)胞等）,AVP或V2R激動劑的應(yīng)用可激活腺苷酸環(huán)化酶,增加 cAMP表達[26],說明耳蝸中存在cAMP介導(dǎo)的AVP依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。研究[27]發(fā)現(xiàn),MD患者血漿AVP水平升高的同時,內(nèi)淋巴囊 cAMP表達水平上調(diào)及活性增強,體外實驗顯示 MD患者內(nèi)淋巴囊cAMP對AVP的敏感性增強。有研究[28]應(yīng)用cAMP拮抗劑碳酸鋰治療MD,結(jié)果使患者眩暈發(fā)作頻率降低,眩暈癥狀減輕。通過動物實驗證實氯化鋰可使動物耳蝸及內(nèi)淋巴囊AQP2 mRNA及蛋白表達水平降低,EH程度減輕。推測鋰化物通過減少內(nèi)耳cAMP生成,減輕cAMP介導(dǎo)的磷酸化作用,使AQP2表達水平及通道開放程度降低,EH程度減輕[29]。本實驗研究結(jié)果顯示,經(jīng)腹腔注射AVP誘導(dǎo)的豚鼠EH模型血漿cAMP、AQP2濃度增加,電針及針刺干預(yù)均可使EH豚鼠血漿內(nèi)異常升高的cAMP、AQP2水平降低。本課題組之前的研究結(jié)果顯示,針刺可使EH豚鼠模型耳蝸及內(nèi)淋巴囊中過度升高的cAMP、AQP2明顯降低[30],與本研究結(jié)果相符[26]。

綜上所述,針刺及電針刺EH模型豚鼠“百會”“聽宮”穴均可以調(diào)節(jié)其cAMP、AQP2血漿含量,減輕螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害。這些共同參與了針刺對耳蝸積水的改善作用。針刺可能通過調(diào)控AVP-cAMP-AQP2系統(tǒng)使全身 AQP2表達下調(diào),水通道開放程度降低,減輕耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間血管水腫及線粒體空泡化變性程度,改善EH模型豚鼠血管紋超微結(jié)構(gòu)的病理狀態(tài),減輕 EH。實驗結(jié)果還提示,無論頻率高低,電針治療均對EH模型豚鼠血漿cAMP、AQP2水平有良性調(diào)整作用,但血漿cAMP、AQP2水平的降低及耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改善在高頻電針（100 Hz）的療效下更為明顯,此結(jié)果可能為解釋 100 Hz高頻電針減輕 EH更優(yōu)于2 Hz低頻電針機制提供依據(jù)。本實驗是僅在相同刺激時間及刺激強度條件下,以頻率為 2 Hz（低頻）和 100 Hz（高頻）的電針進行實驗的探究性思考,但除了以上條件,關(guān)于電針治療 MD還存在許多額外的影響。因此在今后的探索中,還應(yīng)進一步對研究其他電針參數(shù)（如電針強度、留針時間、療程等）的干預(yù)效應(yīng),并分析其具體機制。同時,軋造影劑增強核磁共振技術(shù)已廣泛運用于人類內(nèi)耳疾病的研究,其成像能夠清晰顯示內(nèi)耳具體生理結(jié)構(gòu)及病理改變。因此在后續(xù)實驗中,應(yīng)關(guān)注核磁共振技術(shù)對于實驗結(jié)果成像的反映情況,進一步減少實驗誤差,驗證實驗規(guī)律。