李 潔，陳 琳，劉海棠, ，劉 銳，朱銘強(qiáng)

(1. 中國(guó)輕工業(yè)造紙與生物質(zhì)精煉重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2. 食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院，楊凌 712100)

銀條菜屬唇形科水蘇屬多年生草本植物，主要分布于中國(guó)河南省偃師市．銀條菜中富含蛋白、碳水化合物和脂肪，經(jīng)常食用對(duì)人體有多種保健效果，延年益壽作用明顯，并且具有增強(qiáng)免疫能力、軟化血管、降血脂、改善血液循環(huán)等功能[1]．銀條多糖具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)[2]、腸道益生[3]、降血糖[4]、抑菌[5]、解酒護(hù)肝、抗腫瘤等[6]．以銀條菜作為原料提取的水蘇糖，具有重要的藥用及醫(yī)用價(jià)值，這也為銀條菜的綜合利用開辟了新途徑[7]．

通常情況下，水提或者醇提獲得的多糖往往含有蛋白[8]，而蛋白的存在可能會(huì)影響多糖的生物活性.因此，如何有效去除蛋白且同時(shí)避免多糖生物活性降低，成為一個(gè)非常有意義的研究課題．不同來(lái)源的多糖有各自適宜的脫蛋白方法．初雅潔[9]通過對(duì)辣木多糖除蛋白的研究，發(fā)現(xiàn)酶法除蛋白對(duì)辣木多糖的蛋白脫除率和多糖保留率最好．王新嘉等[10]研究發(fā)現(xiàn)三氯乙酸法(TCA法)除蛋白對(duì)平菇多糖中蛋白的脫除率最高，多糖保留率最好．而對(duì)銀條菜多糖目前尚未見其脫蛋白的相關(guān)研究報(bào)道．

本文采用TCA法、鹽析法以及鹽酸法對(duì)銀條菜粗多糖進(jìn)行脫蛋白方法研究，為后續(xù)銀條菜多糖的分離純化以及生物活性的探究提供依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

銀條菜購(gòu)于河南省偃師市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)．三氯乙酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白、苯酚，北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)G250、無(wú)水氯化鈣，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，阿拉丁(上海)試劑有限公司；無(wú)水乙醇，天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；鹽酸，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；半乳糖醛酸，上海瑞永生物科技有限公司；蒽酮，北京博奧拓達(dá)科技有限公司．本實(shí)驗(yàn)所用試劑純度均為分析純．

TU-1810型紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；BAO-150A型精密鼓風(fēng)干燥箱，施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司；DFT-50A型50克手提式高速粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗多糖的提取[11]

銀條菜清洗干凈后，于60℃恒溫干燥箱中烘至質(zhì)量恒定，粉碎機(jī)中磨碎，過80目篩，裝入聚乙烯瓶中，放入干燥器中備用．取處理好的樣品與蒸餾水按質(zhì)量比1∶30混合，放入超聲清洗機(jī)中超聲處理30min，抽濾；收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的五分之一，加入4倍體積無(wú)水乙醇，4℃放置24h，離心收集沉淀；將沉淀依次用無(wú)水乙醇、乙醚洗滌，再于60℃烘箱中烘至質(zhì)量恒定，得到銀條菜粗多糖．

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

通過苯酚-硫酸法[12]測(cè)定銀條菜粗多糖中的多糖含量．用電子天平稱量烘至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品100.00mg，用蒸餾水定容至100.00mL，配制成1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液備用．取1mL儲(chǔ)備液定容至10mL，得到100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液．分別取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL標(biāo)準(zhǔn)液置于10mL具塞試管中，再分別加蒸餾水將體積補(bǔ)至1.00mL．向各試管中加入1.00mL的6.00%苯酚溶液(體積分?jǐn)?shù))，再加入5.00mL濃硫酸，混合均勻．于沸水浴中加熱30min，取出后冷卻，用紫外分光光度計(jì)在490nm處以蒸餾水為參比測(cè)定吸光度，測(cè)3組平行樣，取平均值．以葡萄糖質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．所得曲線為y＝0.0072x－0.0066，R2＝0.9997．

取粗多糖用蒸餾水配制成10.00mg/mL的溶液，再用蒸餾水稀釋100倍，量取1.00mL稀釋液于試管中，測(cè)定吸光度，將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算葡萄糖質(zhì)量濃度(μg/mL)．按照式(1)計(jì)算多糖保留率．

式中：ρ0為樣品脫除蛋白前所配制溶液中多糖的質(zhì)量濃度；ρ1為樣品脫除蛋白后所配制溶液中多糖的質(zhì)量濃度．

1.2.3 蛋白含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G250法對(duì)銀條菜粗多糖中的蛋白進(jìn)行測(cè)定．取10.00mg牛血清蛋白用蒸餾水定容至100mL得到100μg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液．稱量25mg的考馬斯亮藍(lán)G250試劑溶解于12.50mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，加入25.00mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的磷酸，用蒸餾水定容至250mL，得到考馬斯亮藍(lán)G250工作液．分別取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管內(nèi)，用蒸餾水將體積補(bǔ)至1mL，分別加入5.00mL考馬斯亮藍(lán)G250工作液，混合均勻，放置反應(yīng)2min，用紫外分光光度計(jì)在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，測(cè)3組平行樣，取平均值．以蛋白溶液質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．所得曲線為y＝0.0063x－0.0113，R2＝0.9977．

稱量粗多糖樣品，用蒸餾水配制成10.00mg/mL的溶液，量取1.00mL，按照上文所述方法進(jìn)行操作，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)量濃度(μg/mL)進(jìn)行測(cè)定．按照式(2)計(jì)算蛋白去除率．

式中：ρ2為樣品脫除蛋白前所配制溶液中蛋白的質(zhì)量濃度；ρ3為樣品脫除蛋白后所配制溶液中蛋白的質(zhì)量濃度．

1.2.4 糖醛酸含量的測(cè)定

采用咔唑硫酸改良法[13]測(cè)定糖醛酸的含量．精確稱量10.00mg半乳糖醛酸，用蒸餾水定容至100mL，得到質(zhì)量濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用．配制四硼酸鈉-硫酸溶液，稱取0.956g四硼酸鈉溶于200mL濃硫酸中．分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL置于具塞試管中，加蒸餾水將體積補(bǔ)至0.50mL；將試管放入冰水浴中，分別加入3.0mL四硼酸鈉-硫酸溶液，混勻后于85℃的水浴中加熱20min，取出冷卻后，加入0.10mL 0.10%的咔唑-無(wú)水乙醇溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，混合均勻后，室溫下反應(yīng)2h．用紫外分光光度計(jì)在530nm處測(cè)吸光度，測(cè)3組平行樣，取平均值．以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．所得曲線為y＝0.006x－0.0158，R2＝0.9913．

稱取粗多糖樣品配制成10.00mg/mL溶液，稀釋5倍，取0.50mL于試管中，按上文所述方法，對(duì)樣品中糖醛酸質(zhì)量濃度(μg/mL)進(jìn)行測(cè)定．按照式(3)計(jì)算糖醛酸保留率．

式中：ρ4為樣品脫除蛋白前所配制溶液中糖醛酸的質(zhì)量濃度；ρ5為樣品脫除蛋白后所配制溶液中糖醛酸的質(zhì)量濃度．

1.3 脫蛋白方法

1.3.1 TCA法[14-15]

取1.2.1節(jié)中提取到的粗多糖配制成10.00mg/mL的溶液50mL，在溶液中分別加入相等體積的體積分?jǐn)?shù)分別為2.00%、5.00%、10.00%、15.00%、20.00%的三氯乙酸溶液，混合均勻后于4℃放置12h，抽濾去除沉淀，得到脫蛋白溶液．

1.3.2 鹽析法[16]

取1.2.1節(jié)中提取到的粗多糖配制成10.00mg/mL溶液50mL，用NaOH溶液調(diào)節(jié)粗多糖溶液pH為8.0，水浴加熱至85℃，分別加入0.10、0.30、0.50、0.70、0.90g無(wú)水CaCl2，混勻后沸水浴30min；取出后冷卻至室溫，抽濾去除沉淀，得到脫蛋白溶液．

1.3.3 鹽酸法[17]

取1.2.1節(jié)中提取到的粗多糖配制成10mg/mL溶液50mL，用2mol/L鹽酸溶液分別調(diào)節(jié)粗多糖溶液pH為1、2、3、4、5，4℃保存12h，抽濾除去沉淀，得到脫蛋白溶液．

1.4 紫外光譜分析

將未脫蛋白溶液和已脫蛋白溶液均稀釋10倍，用紫外分光光度計(jì)于200～400nm進(jìn)行光譜掃描．

2 結(jié)果與討論

2.1 TCA法

TCA溶液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)溶液中蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影響如圖1所示．

圖1 TCA溶液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影響Fig. 1 Effectof the volume fraction of TCA solution on protein removal rate，polysaccharide retention rate and uronic acid retention rate

由圖1可知：蛋白去除率隨著TCA溶液體積分?jǐn)?shù)的增大而降低．在TCA溶液的體積分?jǐn)?shù)為5.00%時(shí)，蛋白去除率達(dá)到97.25%，隨著添加TCA體積分?jǐn)?shù)的增大，去除率略微下降．多糖保留率隨TCA體積分?jǐn)?shù)的增大而明顯降低，在TCA溶液體積分?jǐn)?shù)為5.00%時(shí)達(dá)到86.89%．這可能是由于多糖中蛋白的等電點(diǎn)對(duì)應(yīng)pH與溶液的pH 接近，而且TCA 作為變性劑使蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出更多的疏水基團(tuán)而聚集沉淀，而蛋白沉淀的同時(shí)，吸附了一定量的多糖造成損失[18]．高濃度的TCA可以在一定的程度上造成銀條菜多糖水解，進(jìn)而引起多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[19-20]．糖醛酸保留率呈先增后減的趨勢(shì)，在TCA溶液的體積分?jǐn)?shù)為5.00%時(shí)達(dá)到最大98.67%，這可能是由于糖醛酸在酸性條件下發(fā)生水解．雖然TCA體積分?jǐn)?shù)2.00%時(shí)多糖保留率是最大的，但是2.00%和5.00%時(shí)兩者的多糖保留率相差不到1.00%，而糖醛酸保留率差距較大；故綜合考慮糖醛酸保留率、多糖保留率以及蛋白去除率等指標(biāo)，TCA溶液的體積分?jǐn)?shù)為5.00%時(shí)綜合效果最好，所以，TCA法除蛋白時(shí)，確定TCA溶液的最佳體積分?jǐn)?shù)為5.00%．

2.2 鹽析法

無(wú)水CaCl2添加量對(duì)蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影響如圖2所示．

圖2 無(wú)水CaCl2添加量對(duì)蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影響Fig. 2 Effect of addition to anhydrous CaCl2 on protein removal rate，polysaccharide retention rate and uronic acid retention rate

由圖2可知：樣品中蛋白去除率隨著無(wú)水氯化鈣添加量的增大而呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，無(wú)水CaCl2添加量為0.30g時(shí)達(dá)到最大值90.61%，此后隨著無(wú)水氯化鈣添加量的增加而逐漸降低．溶液中多糖和糖醛酸的含量隨著無(wú)水CaCl2的添加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在無(wú)水CaCl2添加量為0.30g時(shí)保留率最大，分別為83.59%、88.67%．這可能是由于隨著中性鹽濃度的增加，蛋白表面的水化膜和電性被破壞而發(fā)生沉降[21]，但其沉降的蛋白會(huì)對(duì)多糖溶液中的多糖和糖醛酸產(chǎn)生吸附作用，進(jìn)而造成多糖和糖醛酸的損失[22]．選擇無(wú)水CaCl2的添加量為0.30g作為最佳處理?xiàng)l件．

2.3 鹽酸法

pH對(duì)蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影響如圖3所示．由圖3可知：隨著pH的升高，蛋白去除率略有波動(dòng)，但均較高，在pH＝3時(shí)，蛋白去除率最大，為95.92%；隨著pH的增大，多糖保留率先增加后減小，在pH＝3時(shí)，多糖保留率最高，為86.31%，這可能是由于多糖在強(qiáng)酸條件下發(fā)生了水解[23]．糖醛酸保留率受pH的影響較大，在pH＝1時(shí)，糖醛酸保留率為59.27%，但pH＝3時(shí)，糖醛酸保留率達(dá)到了95.03%，這可能是由于糖醛酸在劇烈的水解條件下很容易發(fā)生脫羧反應(yīng)．故鹽酸法除蛋白的最適pH為3．

圖3 pH對(duì)蛋白去除率、多糖保留率、糖醛酸保留率的影響Fig. 3 Effect of pH on protein removal rate，polysaccharide retention rate and uronic acid retention rate

2.4 3種脫蛋白方法的比較

將3種脫蛋白方法在各自最優(yōu)條件下獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖4所示．

圖4 TCA法、鹽析法、鹽酸法脫蛋白結(jié)果比較Fig. 4 Comparison ofthe results of deproteinization by TCA method，salting out method and hydrochloric acid method

從圖4中可以看出：用無(wú)水氯化鈣鹽析脫蛋白的效果最差，它對(duì)蛋白的去除率低，對(duì)多糖和糖醛酸的保留率差；TCA法和鹽酸法脫蛋白的效果都較好，在最優(yōu)條件下蛋白去除率都達(dá)到95.00%以上，兩種方法對(duì)多糖都有較好的保留效果，TCA法中糖醛酸保留率更高一些，最優(yōu)條件下達(dá)到98.67%．

2.5 紫外光譜分析

不同樣品的紫外光譜如圖5所示．從圖5中可以看出：脫蛋白樣品和未脫蛋白樣品的紫外光譜有明顯的區(qū)別．蛋白因氨基酸殘基中的苯環(huán)上有共軛雙鍵而在280nm處對(duì)紫外有吸收[24]，故而樣品掃描光譜在280nm處有吸收峰．掃描曲線的結(jié)果顯示，在280nm前后，3種脫蛋白方法處理的樣品相對(duì)于未脫蛋白的樣品沒有明顯吸收峰，表明這3種脫蛋白方法都有明顯脫除蛋白的效果．

圖5 不同樣品的紫外掃描光譜Fig. 5 UV scanning spectra of different samples

3 結(jié) 論

TCA法、鹽析法、鹽酸法對(duì)銀條菜粗多糖都有較好的脫蛋白效果．TCA法在TCA溶液體積分?jǐn)?shù)為5.00%時(shí)，蛋白去除率為97.25%；鹽析法中無(wú)水氯化鈣的添加量為0.30 g時(shí)，蛋白去除率為90.61%；鹽酸法調(diào)節(jié)pH為3時(shí)，蛋白去除率為95.92%；3種方法相應(yīng)的多糖保留率分別為86.89%、83.59%、86.31%，糖醛酸保留率分別為98.67%、88.67%、95.03%．故而在這3種脫蛋白方法中TCA法的效果最好，鹽酸法次之，鹽析法的效果最不理想．由此證明TCA 法是一種能夠相對(duì)有效去除銀條菜多糖中蛋白且多糖和糖醛酸保留較好的一種方法．