王盛昊，于 冰

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

尿嘧啶出現(xiàn)在DNA中是由dUTP的錯誤引入或者胞嘧啶的自發(fā)脫氨導(dǎo)致的[1]。在生物體中，尿嘧啶錯誤引入會導(dǎo)致U:A錯配，具有細(xì)胞毒性[2]，而去氨基胞嘧啶會產(chǎn)生U:G錯配，如果在復(fù)制前不修復(fù)，會導(dǎo)致C:G到T:A轉(zhuǎn)換突變[3]。為應(yīng)對產(chǎn)生尿嘧啶這類DNA損傷，細(xì)胞形成了多種DNA修復(fù)機(jī)制。一種途徑是細(xì)胞通過脫氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶（dUTPase）將dUTP水解為dUMP降低dUTP的含量，從而減少尿嘧啶的錯誤摻入[4]。另一種更為重要的途徑是細(xì)胞通過堿基切除修復(fù)（base-excision repair，BER）有效去除錯誤摻入和自發(fā)脫氨的尿嘧啶。尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase，UDG）負(fù)責(zé)切除尿嘧啶，該酶活性能夠裂解N-糖苷鍵，將尿嘧啶作為游離堿基去除，在DNA中產(chǎn)生一個無堿基的（apurinic apyrimidinic site，AP）位點(diǎn)[5]。修復(fù)是通過隨后的步驟完成的，包括在AP部位切開、產(chǎn)生缺口、修復(fù)合成缺口和連接磷酸二酯鍵[6]。

1974年Lindahl課題組[7]首次從大腸桿菌提取物中檢測到UDG酶活性。此后，在真核、原核等生物中均發(fā)現(xiàn)了UDG并進(jìn)行了原核表達(dá)[8-10]。DNA糖基化酶根據(jù)特征基序可以分為UDG超家族和螺旋-發(fā)夾-螺旋-GPD糖基化酶（Helix-Hairpin-Helix-GPD glycosylases，HHH-GPD）超家族，HHH-GPD超家族具有標(biāo)志性的螺旋-發(fā)夾-螺旋和甘氨酸/脯氨酸（Gly，G/Pro，P）富含環(huán)，其后是一個保守的天冬氨酸（Asp，D）。UDG超家族根據(jù)保守的基序和結(jié)構(gòu)相似性又可以分為UDG-F1、UDG-F2、UDG-F3、UDG-F4和UDG-F5共5個亞家族。UDG-F1以大腸桿菌UNG（uracil N-glycosylase）酶和人類UNG酶為代表，一般UDG-F1亞家族蛋白也被稱為UNG，主要切除由胞嘧啶自發(fā)脫氨形成的尿嘧啶并在dsDNA和ssDNA上都有活性[11-12]。UNG與底物結(jié)合發(fā)生在一個“口袋”中，其可以提供尿嘧啶的形狀和靜電作用，并且這個“口袋”不能容納嘌呤。對蛋白進(jìn)行結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，尿嘧啶的結(jié)合需要“核苷酸旋轉(zhuǎn)”后才能實現(xiàn)，位于口袋正上方保守亮氨酸（Leu）可以幫助實現(xiàn)這一過程[11]。UNG包括3個保守的基序，第1個是水激活基序（在人類UNG中為GQDPYH），其可以和催化中心的水分子配位。其在UDG-F1和UDG-F2中高度相似，但是UDG-F1中的D（天冬氨酸）在UDG-F2中為N（天冬酰胺），這是區(qū)分UDG-F1和UDG-F2的標(biāo)志。第2個是尿嘧啶結(jié)合基序（GVLLLN），該基序在UNG家族中保守，通過與尿嘧啶環(huán)上的極性分子形成氫鍵識別尿嘧啶[13]。第3個基序是小溝插入環(huán)基序（HPSPLS），它在驅(qū)動尿嘧啶進(jìn)入口袋的過程具有重要作用，其組氨酸（H）和第一個脯氨酸（P）具有高度的保守型。UDG-F2以大腸桿菌MUG和人類TDG為代表，與UDG-F1不同的是UDGF2的主要作用之一是去除錯誤摻入的dUMP殘基并對dsDNA具有依賴性[14]。UDG-F3以脊椎動物的SMUG1代表，相較UDG-F1和UDG-F2其不僅可以修復(fù)尿嘧啶還可修復(fù)5-羥甲基尿嘧啶（5-HMU）、3,N4-乙烯胞嘧啶（?C）和5-氟尿嘧啶（5-FU）引起的突變，并對dsDNA和ssDNA都有活性。人們還在嗜熱菌和古菌中鑒定出UDG-F4和UDG-F5[15]。

與細(xì)菌、酵母和哺乳動物中的UDG相關(guān)研究相比，對植物中尿嘧啶切除修復(fù)的了解仍然非常有限。已經(jīng)從胡蘿卜、小麥、洋蔥和玉米等植物的離體組織中初步提取了含有UDG的活性物質(zhì)并檢測了UDG活性[3,6,16-17]。Dolores等[3]克隆獲得了擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtUNG基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其屬于UDG-F1，將其在大腸桿菌中異源表達(dá)并純化得到AtUNG蛋白，檢測活性發(fā)現(xiàn)其具有UDG酶活性，對dsDNA、ssDNA均有活性，并表現(xiàn)出對ssDNA更好的偏好性。

甜菜M14品系是郭德棟[18]利用二倍體栽培甜菜（Beta vulgaris）與四倍體野生白花甜菜（Beta corolliflora）雜交及回交獲得的甜菜單體附加系，含有1條附加的野生白花甜菜第9號染色單體[19]，具有耐鹽、無融合生殖等特性，是克隆抗逆基因和其他優(yōu)質(zhì)基因的特殊種質(zhì)資源。實驗室前期對甜菜M14品系的Bv-MDHAR、BvM14-glyoxalase I、BvM14-cystatin等多個基因進(jìn)行了耐鹽基因功能研究[20-23]。

生物都具有DNA修復(fù)系統(tǒng)[24]，為提高對于各種逆境脅迫的耐受性以保證生存[25]，植物進(jìn)化出了多種特殊機(jī)制來應(yīng)對環(huán)境變化，一種DNA修復(fù)酶通常具有多種不同功能[26]，或同一功能可由多種不同的DNA修復(fù)酶執(zhí)行。甜菜M14品系是具有耐鹽、無融合生殖等優(yōu)良特性的植物材料，因此是挖掘和利用DNA修復(fù)酶的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。Bv-UNG在甜菜M14中的功能尚未明確，本研究對甜菜M14品系Bv-UNG基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，旨在為進(jìn)一步探究Bv-UNG蛋白活性以及在BER途徑的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以甜菜M14品系（專利號CN1263695A）作為植物材料，種植于植物培養(yǎng)室。

1.1.2 主要試劑和引物 pMD18-T Vector Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit、Ex Taq、DNA Marker、感受態(tài)細(xì)胞DH5α RNAPCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒均購于TaRaKa公司。根據(jù)NCBI二倍體甜菜DNA序列設(shè)計引物，實驗訂購的引物（表1）均由上海生工負(fù)責(zé)合成。

表1 實驗所需引物

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 利用TRIzol試劑提取甜菜M14品系根部總RNA。檢測總RNA樣品的A260/A280及RNA的完整性。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成 參照趙冬美[21]的方法進(jìn)行甜菜M14品系cDNA第一鏈的合成。反轉(zhuǎn)錄的實驗條件為30℃ 10 min、42℃ 30 min、99℃ 5 min、5℃ 5 min。

1.2.3 BvM14-UNG基因cDNA的獲得 使用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計BvM14-UNG基因的上游和下游的特異性引物BvM14-UNG-S、BvM14-UNGAS。以BvM14 cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 BvM14-UNG基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI網(wǎng)站中的ORF Finder程序、CDD、Blast程序分別進(jìn)行開放閱讀框分析、保守結(jié)構(gòu)域分析、BvM14-UNG基因進(jìn)行同源序列搜索；利用Expasy網(wǎng)站、ProParam軟件對親/疏水性和蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用SMART軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的預(yù)測；利用SOPMA軟件、Swiss-model數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測；利用DNAMAN、MEGA 5軟件進(jìn)行蛋白多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 BvM14-UNG基因的克隆

2.1.1 總RNA的提取 利用TRIzol提取甜菜M14品系葉和根部的總RNA，A260/A280分別為1.95、1.96，濃度為1.92、1.93 μg/μL。電泳檢測結(jié)果如圖1，電泳結(jié)果表明提取的RNA純度較高。

圖1 鹽脅迫下甜菜M14品系根總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.1.2 BvM14-UNG基因cDNA全長的獲得 以cDNA第一鏈為模板，利用BvM14-UNG-S和BvM14-UNGAS進(jìn)行PCR，產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖2所示。BvM14-UNG基因PCR擴(kuò)增條帶大小在1000 bp和2000 bp之間，測序結(jié)果正確。

圖2 BvM14-UNG基因cDNA全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 BvM14-UNG基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 BvM14-UNG基因的ORF分析 經(jīng)過分析，cDNA序列全長為1124 bp（包括終止密碼子），編碼374個氨基酸。如圖3中黑色方框和紅色方框為起始密碼子和終止密碼子。

圖3 BvM14-UNG基因cDNA全長開放閱讀框分析

2.2.2 BvM14-UNG蛋白的理化性質(zhì)分析 預(yù)測BvM14-UNG蛋白分子式為C1866H2940N520O547S11,等電點(diǎn)（pI）為9.19，分子量為41763.69 Da。

BvM14-UNG蛋白/親疏水性分析如圖4所示。最高分值（疏水性最強(qiáng)）出現(xiàn)在第270位為2.133，最低分值（親水性最強(qiáng)）出現(xiàn)在第66位為-2.989，親水性氨基酸占比較多。

圖4 BvM14-UNG蛋白親/疏水性預(yù)測結(jié)果

2.2.3 BvM14-UNG蛋白的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 BvM14-UDG蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果如圖5所示。BvM14-UNG蛋白中無規(guī)卷曲（黃色c）占比41.18%，α螺旋（藍(lán)色h）占比為30.21%，延伸鏈（紅色e）占比21.39%，β轉(zhuǎn)角（綠色t）占比7.22%。該蛋白主要由無規(guī)卷曲和α螺旋構(gòu)成。

BvM14-UNG蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖6所示。BvM14-UNG蛋白水激活基序（Motif Ⅰ）能夠形成類似于“口袋”結(jié)構(gòu)（圖6紅色部分），尿嘧啶結(jié)合基序（Motif Ⅱ）與“口袋”緊鄰。尿苷酸進(jìn)入口袋后不能直接和Motif Ⅱ（圖6綠色部分）結(jié)合，需要借助與Motif Ⅱ位置相對的Leu位點(diǎn)（圖6黑色部分），使尿苷酸翻轉(zhuǎn)才可以與Motif Ⅱ結(jié)合。

圖6 BvM14-UNG蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

2.2.4 BvM14-UNG蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析如圖7所示，BvM14-UNG蛋白具有水激活基序（Motif Ⅰ）、尿嘧啶結(jié)合基序（Motif Ⅱ）、小溝插入環(huán)基序（Motif Ⅲ）、UGI結(jié)合位點(diǎn)和Leu位點(diǎn)，具有UDG家族保守結(jié)構(gòu)域。

圖7 BvM14-UNG保守結(jié)構(gòu)域分析

2.2.5 BvM14-UNG蛋白同源序列比對 采用NCBI網(wǎng)站在線Blastp工具對BvM14-UNG蛋白與甜菜（Beta vulgaris）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、藜麥（Chenopodium quinoa）、河岸葡萄（Vitis riparia）、葡萄（Vitis vinifera）、菠菜 （Spinacia oleracea）、雷公藤（Tripterygium wilfordii）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、木薯（Manihot esculenta）、可可（Theobroma cacao）、烏木?？?（Herrania umbratica）、碧桃 （Prunus persica）、梅（Prunus mume）、歐洲甜櫻桃（Prunus avium）、扁桃（Prunus dulcis）、荷花（Nelumbo nucifera）、吉野櫻變種（Prunus yedoensis var.nudiflora）、黃薯蕷亞種（Dioscorea cayenensis subsp.rotundata）物種的UNG蛋白進(jìn)行檢索，利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對，如圖8所示，BvM14-UNG蛋白具有水激活基序（Motif Ⅰ）、尿嘧啶結(jié)合基序（Motif Ⅱ）、小溝插入環(huán)基序（Motif Ⅲ）、UGI結(jié)合位點(diǎn)和Leu位點(diǎn)，并且在BvM14-UNG水激活基序（Motif Ⅰ）中為天冬氨酸（D），而非天冬酰胺（N），符合UDG-F1的序列特點(diǎn)，因此確定BvM14-UNG蛋白屬于UDG-F1家族。多重序列比對結(jié)果表明，BvM14-UNG蛋白序列與甜菜的BvUNG氨基酸序列相似度高達(dá)98%，其次為藜麥CqUNG，相似性高達(dá)80.05%。利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析如圖9，表明BvM14-UNG與甜菜BvUNG親緣性最近，其次為藜麥。

圖8 BvM14-UNG蛋白多重序列比對結(jié)果

圖9 BvM14-UNG蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

3 結(jié)論與討論

UNG是UDG超家族中重要的亞家族，UNG是尿嘧啶BER途徑中的第1個酶。UNG在人及其他動物中研究比較深入，但是在植物中的研究相對較少。Bones等[17]檢出了玉米、煙草、油菜、蘿卜、土豆等高等植物中UNG的酶部分活性，并未對UNG活性進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。

筆者從甜菜M14品系中克隆獲得BvM14-UNG基因的cDNA全長序列。生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼374個氨基酸，pI為9.19，分子量為41763.69 Da；BvM14-UNG蛋白表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性，可能為可溶性蛋白；BvM14-UNG蛋白主要由無規(guī)卷曲和α螺旋構(gòu)成；對BvM14-UNG蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，表明其具有水激活基序、尿嘧啶結(jié)合基序、小溝插入環(huán)基序、UGI結(jié)合位點(diǎn)和Leu位點(diǎn)，具有UDG-F1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，屬于UDG-F1；同源序列比對以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，BvM14-UNG蛋白與甜菜BvUDG蛋白親緣性最近。

本研究僅是從生物信息學(xué)方面探究了BvM14-UNG結(jié)構(gòu)和功能，但是BvM14-UNG蛋白的針對尿嘧啶以及尿嘧啶類似物產(chǎn)生的突變的修復(fù)活性有待證實，BvM14-UNG蛋白是否具有與擬南芥相同的對單鏈更好依賴性也需要更多實驗證明。本研究可為后續(xù)開展甜菜M14品系BER途徑中BvM14-UNG酶活性研究提供參考。