左麗，曠年玲，鄧聰聰，呂興幫，張博，吳逸琳，張永英

（河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000）

抗生素作為廣譜抗菌藥物，對(duì)治療動(dòng)物疾病具有重要作用。但過(guò)度應(yīng)用抗生素，使細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[1]。革蘭氏陰性菌（G-菌）因其獨(dú)特的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象更為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)在多重耐藥、耐藥機(jī)制復(fù)雜等方面，不僅對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失，也為人類食品安全帶來(lái)了巨大隱患。因此，消除細(xì)菌耐藥性恢復(fù)其對(duì)抗菌藥物敏感性成為研究熱點(diǎn)。目前多采用化學(xué)合成的抗菌增敏藥物對(duì)抗細(xì)菌耐藥性，但易產(chǎn)生毒副作用，如十二烷基硫酸鈉（SDS）[2]。中藥來(lái)源豐富、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性、在消除細(xì)菌耐藥方面具有多靶位效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)受到研究者的廣泛關(guān)注[2]。但中藥成分復(fù)雜，藥效成分和含量受產(chǎn)地、收獲季節(jié)、炮制方式等因素影響較大，在動(dòng)物臨床應(yīng)用中受到很多限制。而中藥有效成分避免了中草藥的缺點(diǎn)，同時(shí)還具有多靶性和無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[3]，成為消除細(xì)菌耐藥性方面的研究熱點(diǎn)。文章對(duì)G-菌耐藥性的研究現(xiàn)狀以及耐藥產(chǎn)生機(jī)制、中藥有效成分消除G-菌耐藥性的研究現(xiàn)狀和中藥有效成分協(xié)同消除G-菌耐藥性研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為中藥有效成分逆轉(zhuǎn)G-菌耐藥性提供參考。

1 G-菌耐藥現(xiàn)狀和耐藥產(chǎn)生機(jī)制

1.1 G-菌耐藥現(xiàn)狀

G-菌因具有特殊結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁更易產(chǎn)生耐藥性。與革蘭氏陽(yáng)性菌（G+菌）相比，G-菌細(xì)胞壁主要有3點(diǎn)不同：

（1）G-菌的肽聚糖層更薄。

（2）肽聚糖層外具有親水性和疏水性雙重特性的外膜雙分子層，包含脂多糖（LPS）分子、磷脂和外膜蛋白（OMPs）[4]。上述動(dòng)態(tài)外膜構(gòu)成對(duì)抗抗生素的屏障，大部分抗菌藥物必須穿過(guò)外膜才可具有抗菌作用，其中氯霉素和氨基糖苷類疏水抗生素可利用脂質(zhì)通道進(jìn)入胞內(nèi)，但其他疏水抗生素和極性分子無(wú)法進(jìn)入，可能與LPS作用有關(guān)。

（3）G-菌外膜和細(xì)胞壁之間存在周質(zhì)間隙。β-內(nèi)酰胺類抗生素利用孔蛋白(Porin)等通道蛋白進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)[5]，但具有胞質(zhì)靶點(diǎn)的分子因內(nèi)膜限制而無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[6]，從而無(wú)法達(dá)到治療效果。因此產(chǎn)生的耐藥性難以消除，G-菌疾病的治療更加復(fù)雜[7]。

近年來(lái)多重耐藥菌數(shù)量急劇增加，馮敏燕等[8]測(cè)定2008—2014年山東省不同地區(qū)雞場(chǎng)分離的210株大腸桿菌對(duì)14種抗生素的耐藥性，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對(duì)13種抗生素（多西環(huán)素除外）的耐藥率有所增長(zhǎng)，對(duì)其中10種抗生素的耐藥率增長(zhǎng)1倍甚至更高。Huber等[9]對(duì)2013—2019年加拿大肉雞中沙門氏菌、彎曲桿菌和大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)2014年加拿大實(shí)施家禽業(yè)減少抗生素使用戰(zhàn)略后，耐藥菌對(duì)抗生素的耐藥性下降了6%～38%，表明當(dāng)某一種高耐藥性的抗生素（如頭孢類抗生素）退出臨床使用后，G-菌逐漸會(huì)對(duì)另一種抗生素（如氨基糖苷類抗生素）產(chǎn)生耐藥性，形成惡性循環(huán)。崔瑩等[10]對(duì)河南鄭州生禽肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢出的26株致瀉大腸桿菌耐藥率達(dá)96.15%，其中對(duì)四環(huán)素耐藥率高達(dá)84.62%，對(duì)5種及以上抗生素耐藥的菌株占68%。Lenart-Boron等[11]從某污水處理廠附近河流分離出50株大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)該大腸桿菌對(duì)阿莫西林耐藥菌株高達(dá)90%，氨芐西林耐藥菌株占36%，頭孢菌素耐藥菌株占30%，對(duì)3種及以上抗生素耐藥的大腸桿菌占40%。張立偉[12]對(duì)河北地區(qū)雞源大腸桿菌耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)56株大腸桿菌中對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的菌株最多，對(duì)氨芐西林耐藥的菌株占94.64%，多數(shù)菌株對(duì)5種及以上的抗生素具有耐藥性。Datok等[13]發(fā)現(xiàn)，從尼日利亞某城市出售的300份烤牛肉樣品中分離出的大腸桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)100%，其次是阿莫西林/克拉維酸、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、亞胺培南和頭孢曲松，多重耐藥大腸桿菌占97.5%。上述研究表明，G-菌對(duì)臨床常用的多種抗生素表現(xiàn)較高的耐藥性，且耐藥譜不斷變廣。

1.2 G-菌耐藥產(chǎn)生機(jī)制

細(xì)菌耐藥機(jī)制包括內(nèi)在耐藥和獲得耐藥[9]。內(nèi)在耐藥是編碼染色體DNA的穩(wěn)定遺傳特性，由該屬全部成員共享。細(xì)菌可通過(guò)宿主染色體DNA突變或得到攜帶耐藥基因的染色體獲得耐藥性[14]，其產(chǎn)生機(jī)制主要分為以下5類：

（1）產(chǎn)生使藥物失活的酶。耐藥菌能夠產(chǎn)生通過(guò)水解或修飾作用破壞抗生素結(jié)構(gòu)使其失去活性的酶，如β-內(nèi)酰胺酶可打開(kāi)青霉素和頭孢菌素的內(nèi)酰胺環(huán)，破壞藥物結(jié)構(gòu)使其完全失去抗菌活性；氨基糖苷類抗菌藥物鈍化酶（氨基糖苷?；D(zhuǎn)移酶等）對(duì)氨基糖苷類分子中的必需基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，使其與作用靶位核糖體的親和力大幅降低，如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶使氯霉素乙酰化，失去抗菌作用[15]。

（2）主動(dòng)外排機(jī)制。存在于細(xì)胞膜內(nèi)的蛋白質(zhì)復(fù)合物可排出進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的抗生素和毒素，從而使細(xì)胞內(nèi)有毒化合物濃度降低到亞毒性水平。這些蛋白質(zhì)對(duì)不同結(jié)構(gòu)抗生素的識(shí)別和外排存在不同的位點(diǎn)和機(jī)制[16]。

（3）藥物作用靶點(diǎn)改變。細(xì)菌能夠改變抗生素作用靶位的蛋白結(jié)構(gòu)和數(shù)量，從而影響與藥物的結(jié)合。如肺炎鏈球菌耐紅霉素是由質(zhì)粒介導(dǎo)的甲基化酶使23S rRNA中一個(gè)關(guān)鍵性的腺嘌呤殘基甲基化，使抗菌藥物進(jìn)入胞內(nèi)后無(wú)法與之結(jié)合發(fā)揮作用[17]。

（4）細(xì)胞膜通透性降低。細(xì)胞外膜上的孔蛋白是一種非特異性的、跨越細(xì)胞膜的水溶性擴(kuò)散通道，抗菌藥物必須進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部到達(dá)作用靶點(diǎn)后才能夠發(fā)揮抗菌作用。細(xì)菌的細(xì)胞壁障礙或外膜通透性改變均可嚴(yán)重影響抗菌藥物的抗菌作用，如細(xì)菌細(xì)胞膜微孔缺失，亞胺培南難以進(jìn)入胞內(nèi)，從而失去抗菌作用[15]。

（5）細(xì)菌自身代謝狀態(tài)改變。細(xì)菌可通過(guò)改變自身狀態(tài)逃避藥物作用，休眠狀態(tài)或營(yíng)養(yǎng)缺陷的細(xì)菌耐多種抗生素[10]。生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境，吸附于生物或非生物表面的細(xì)胞群落，能夠阻止藥物滲透到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，具有保護(hù)細(xì)菌逃逸抗菌藥物的殺傷作用[7]。

2 中藥有效成分消除G-菌耐藥性研究現(xiàn)狀

張石磊等[18]研究發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度小檗堿與多重耐藥大腸桿菌共培養(yǎng)3 d后，左氧氟沙星的最低抑菌濃度（MIC）由16 mg/L降至8 mg/L，表明小檗堿對(duì)大腸桿菌耐藥性具有消除作用。Qu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素與耐多黏菌素菌株共培養(yǎng)后，多黏菌素的MIC由4～256 mg/L降至1～64 mg/L，表明槲皮素可顯著提升耐藥菌對(duì)多黏菌素的敏感性。郭巖[20]研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚能夠顯著恢復(fù)MCR-1陽(yáng)性的大腸桿菌、沙門菌以及肺炎克雷伯菌對(duì)多黏菌素的敏感性。由此可見(jiàn)，中藥有效成分可通過(guò)多種耐藥消除機(jī)制降低G-菌大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性。

2.1 酶抑制劑

G-菌能夠產(chǎn)生抗生素的水解酶，使抗生素活性降低或失去活性，以β-內(nèi)酰胺類酶最為普遍[21]，可水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的活性結(jié)構(gòu)，使其失去抗菌活性。其中ESBLs和新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM-1）可降低β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)大腸桿菌的抑制作用。第二類抗生素的水解酶是氨基糖苷類修飾酶（AMEs），包括N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）、O-核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ANT）和O-磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH）[22]，可通過(guò)共價(jià)修飾藥物上的特定氨基或羥基滅活氨基糖苷類抗生素，使抗生素失去抑菌活性。第三類是四環(huán)素鈍化酶，可通過(guò)降解四環(huán)素使其失去活性[20]。曹敏[23]研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素、槲皮素、香紫蘇醇、木樨草素、苦參堿、大蒜素和五味子甲素7種中藥單體對(duì)β-內(nèi)酰胺酶具有一定的抑制作用，其中，蘆薈大黃素對(duì)β-內(nèi)酰胺酶活性抑制作用最強(qiáng)。茶提取物-黃素-3,3二氨基甲（TFDG）也能夠有效抑制ESBLs活性，增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類藥物的藥效[24]。賈芳等[25]研究發(fā)現(xiàn)，2.5～15.0 g/L的苦豆子堿既可對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用，還可降低ESBLs活性。因此，中藥有效成分具有抑制酶活性的能力，可提高耐藥菌株對(duì)抗菌藥物敏感性。

2.2 外排泵抑制劑

G-菌依靠跨越雙膜的3種蛋白復(fù)合體從細(xì)胞中泵出抗生素。3種蛋白復(fù)合體包括抗性結(jié)瘤細(xì)胞分裂（RND）家族的內(nèi)膜蛋白（IMP）、外膜蛋白（OMP）及連接兩個(gè)蛋白的胞膜融合蛋白（MFP）[26]。外排泵具有底物選擇廣泛的特點(diǎn)，以此形成對(duì)抗生素的非特異性耐藥。外排泵抑制劑（EPIs）的研發(fā)對(duì)恢復(fù)多重耐藥G-菌的敏感性具有重要意義。劉三俠[27]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)小檗堿處理的多重耐藥大腸埃希菌外排泵AcrA-mRNA表達(dá)量顯著降低，表明小檗堿能夠抑制細(xì)菌主要外排系統(tǒng)AcrAB-Tolc。Choudhury等[28]研究發(fā)現(xiàn)，香豆素能夠抑制銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵MexB蛋白表達(dá)，抑制細(xì)菌耐藥性。綜上，中藥有效成分能夠顯著抑制G-菌的外排泵作用以及相關(guān)基因的表達(dá)，從而消除細(xì)菌耐藥性。

2.3 生物被膜抑制劑

生物被膜是指細(xì)菌被自身產(chǎn)生的多聚復(fù)合物基質(zhì)包繞的異質(zhì)性細(xì)菌群體，附著于無(wú)活性物體或活體物體表面[15]。一般情況下，生物被膜通過(guò)降低菌體代謝速率和對(duì)抗生素的通透性阻止或減少抗生素進(jìn)入體內(nèi)，進(jìn)而產(chǎn)生抗生素耐藥性[29]。景春娥等[30]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠降低阪崎克羅諾桿菌的附著性，抑制生物被膜形成，且鞭毛合成基因、生物被膜形成相關(guān)基因、生物被膜群體感應(yīng)因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄水平均有所下調(diào)。張凱等[31]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的厚樸酚對(duì)同一耐藥菌生物被膜形成均可產(chǎn)生抑制作用。黃盼等[32]研究發(fā)現(xiàn)，5 g/L的甘草酸可顯著抑制耐藥菌生物被膜形成，10 g/L的甘草酸處理的耐藥菌幾乎不形成生物被膜。綜上，中藥有效成分通過(guò)抑制耐藥G-菌生物被膜形成可消除G-菌耐藥性。

2.4 耐藥質(zhì)粒消除劑

細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性最主要的機(jī)制是獲得耐藥質(zhì)粒[14]。耐藥基因在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移，可整合到細(xì)菌的染色體中，代代穩(wěn)定遺傳，也可在細(xì)菌質(zhì)粒上保持在染色體外狀態(tài)，由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性可伴隨耐藥質(zhì)粒的消除而逆轉(zhuǎn)。汪東海等[33]研究發(fā)現(xiàn)，與處理前相比，經(jīng)0.1～1.0 g/L黃芩苷處理的鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥菌株質(zhì)粒消除率為6.3%～37.5%，且呈劑量依賴性。王新興等[34]研究發(fā)現(xiàn)，MIC濃度的小檗堿可消除MCR-1陽(yáng)性大腸桿菌耐藥質(zhì)粒，消除率為26.9%；經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)小檗堿作用后，由質(zhì)粒編碼的MCR-1基因也被消除。綜上，中藥有效成分通過(guò)消除耐藥質(zhì)粒達(dá)到消除G-菌耐藥性的作用。

3 中藥有效成分協(xié)同消除G-菌耐藥性

G-菌耐藥性產(chǎn)生由多重耐藥機(jī)制介導(dǎo)，單一消除劑無(wú)法抑制全部耐藥機(jī)制，多種消除劑聯(lián)合應(yīng)用才是消除細(xì)菌多重耐藥機(jī)制的有效手段。徐倩倩等[35]研究發(fā)現(xiàn)，黃連-訶子、山楂-蘆薈、蘆薈-烏梅等7對(duì)中藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)顯示協(xié)同作用，F(xiàn)IC指數(shù)為0.28～0.50；黃連-山楂、蘆薈-五味子等9對(duì)藥物聯(lián)合應(yīng)用呈現(xiàn)相加作用，F(xiàn)IC指數(shù)為0.56～1.00；27對(duì)藥物聯(lián)用呈現(xiàn)拮抗作用，F(xiàn)IC指數(shù)均大于2。王芝超[36]發(fā)現(xiàn)，山楂可消除1～3條耐藥大腸桿菌耐藥質(zhì)粒條帶，黃連可抑制耐藥菌β-內(nèi)酰胺酶活性，降低大腸桿菌外排泵AcrAB-TolC轉(zhuǎn)錄水平，生物被膜由強(qiáng)附著性變?yōu)槿醺街裕介S連組方對(duì)雞源大腸桿菌病治愈率達(dá)90%。

4 結(jié)論

目前對(duì)中草藥復(fù)方消除細(xì)菌耐藥研究較多，但中藥成分復(fù)雜，藥效受采摘季節(jié)、產(chǎn)地、炮制方式、制備濃度等諸多因素影響，導(dǎo)致臨床治療細(xì)菌性疾病尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。而藥效明確、濃度可控的中藥有效成分可避開(kāi)此弊端，更具臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，研發(fā)多靶點(diǎn)消除細(xì)菌多重耐藥性的中藥有效成分消除劑是發(fā)展趨勢(shì)。