王桂芳，索金偉，王 哲，成 豪，胡淵淵，張可偉，吳家勝

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；3. 浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育一般具有較長(zhǎng)周期，外形上表現(xiàn)為由小變大，內(nèi)部伴隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累與代謝[1]。果實(shí)大小主要由細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨大2個(gè)階段決定，發(fā)育前期主要以細(xì)胞分裂為主，而細(xì)胞膨大主要是從細(xì)胞分裂結(jié)束后開(kāi)始的[1]。不同物種果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育有著不同的特性。核桃Juglans regia、板栗Castanea mollissima等生長(zhǎng)發(fā)育隨時(shí)間變化呈現(xiàn)“S”形的生長(zhǎng)曲線[2]，桃Amygdalus persica、杏Armeniaca vulgaris等在生長(zhǎng)中會(huì)有一個(gè)緩慢期，生長(zhǎng)曲線呈雙“S”形[3]。山核桃Carya cathayensis果實(shí)5月初開(kāi)始膨大，6—7月果實(shí)快速生長(zhǎng)[4]。銀杏Ginkgo biloba授粉后40～80 d為快速膨大階段，縱徑和體積增長(zhǎng)顯著[5]。果實(shí)膨大過(guò)程涉及一系列生理生化變化[1]。果實(shí)內(nèi)部光合同化物的積累與代謝是果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控中心環(huán)節(jié)，直接影響果實(shí)膨大過(guò)程。蔗糖是植物光合同化物的主要積累物質(zhì)，是重要的能量載體，在果實(shí)中積累后會(huì)被分解為葡萄糖和果糖[6]。這些小分子還原糖進(jìn)一步參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等過(guò)程，為果實(shí)早期發(fā)育和細(xì)胞膨大提供能量和碳骨架[7]。同時(shí)，蔗糖、葡萄糖、果糖通過(guò)區(qū)隔積累于液泡中，使果實(shí)內(nèi)部保持較高的膨壓，促進(jìn)水分吸收，從而促進(jìn)果實(shí)細(xì)胞膨大[8]。此外，旺盛的蔗糖代謝也有利于果實(shí)內(nèi)部?jī)?nèi)源激素的積累與分配，提高果實(shí)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)運(yùn)能力，使更多的光合同化產(chǎn)物、礦質(zhì)元素源源不斷地流入正在發(fā)育的果實(shí)細(xì)胞，滿足果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)需求[8]。果實(shí)中的蔗糖主要源于葉片光合同化物的韌皮部輸入，運(yùn)輸?shù)綆?kù)器官后通過(guò)其代謝過(guò)程被進(jìn)一步利用[9]。蔗糖代謝過(guò)程涉及到多種酶，主要有蔗糖合成酶(sucrose synthase, SS)，蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)和蔗糖轉(zhuǎn)化酶(invertase)。這些蔗糖代謝相關(guān)酶的活性變化對(duì)果實(shí)發(fā)育過(guò)程有著重要影響[10]。研究發(fā)現(xiàn)：果實(shí)中蔗糖磷酸合成酶活性與蔗糖積累呈正相關(guān)關(guān)系[11]。GALTIER等[12]在番茄Lycopersicon esculentum中過(guò)量表達(dá)蔗糖磷酸合成酶基因，轉(zhuǎn)基因番茄中蔗糖磷酸合成酶蛋白含量升高，同時(shí)其含糖量也增加。蔗糖水解成己糖后可為果實(shí)發(fā)育提供能量，參與蔗糖水解的酶主要有蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶。蔗糖轉(zhuǎn)化酶根據(jù)在細(xì)胞中的定位不同可以分為細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶(cell wall invertase)、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶(vacuolar invertase)和細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶(cytoplasmic invertase)[10]。蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性高低可以作為衡量果實(shí)庫(kù)活力的重要標(biāo)志[13]。番茄轉(zhuǎn)化酶活性在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)階段都有較高水平，有利于己糖積累[14]。蜜柑Satsuma mandarin果實(shí)快速膨大期液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較高[15]。蔗糖合成酶既可以合成蔗糖也可以分解蔗糖。在果實(shí)膨大過(guò)程中，蔗糖合成酶主要起著分解蔗糖的作用[16]。此外，果實(shí)內(nèi)部蔗糖代謝過(guò)程也會(huì)受到植物激素、光照和水分等因子的影響。研究發(fā)現(xiàn)：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)能夠增強(qiáng)蔗糖運(yùn)輸，促進(jìn)蔗糖向果肉細(xì)胞擴(kuò)散[17]。葡萄Vitis vinifera果實(shí)發(fā)育前期，IAA和赤霉素(gibberellins，GAs)促進(jìn)了果實(shí)中蔗糖的輸入[18]。外源GA處理通過(guò)增強(qiáng)蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因表達(dá)，提高果實(shí)蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性，促進(jìn)枇杷Eriobotrya japonica等果實(shí)膨大[19]。

香榧Torreya grandis ‘Merrillii’是紅豆杉科Taxaceae榧樹(shù)屬Torreya植物，是中國(guó)特有的珍稀干果。香榧種仁營(yíng)養(yǎng)豐富，具有很高的保健、藥用和綜合開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[20?22]。然而，人們?cè)陂L(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，香榧種實(shí)膨大率低，部分香榧林分膨大率不足5%，嚴(yán)重影響香榧的產(chǎn)量和栽培效益，成為限制香榧產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。本研究通過(guò)分析香榧種實(shí)膨大過(guò)程中蔗糖積累與代謝規(guī)律，探討內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化及其與蔗糖代謝之間的相關(guān)性，初步闡明蔗糖及其代謝對(duì)香榧種實(shí)膨大的影響。同時(shí)，篩選鑒定蔗糖代謝關(guān)鍵酶相關(guān)基因，分析蔗糖代謝對(duì)香榧種實(shí)膨大的調(diào)控作用。研究結(jié)果將為闡明香榧種實(shí)發(fā)育機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為提高種實(shí)產(chǎn)量、開(kāi)展良種選育等提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本研究試驗(yàn)地位于浙江省杭州市臨安區(qū)錦源村香榧生態(tài)化種植示范基地(30°09′45″N，119°42′36″E)。該種植基地屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年均日照時(shí)數(shù)為1 710～2 100 h，年均氣溫為15.0～18.0 ℃，年均降水量為980.0～2 000.0 mm?；貎?nèi)的香榧于2007年種植，每年施用復(fù)合肥2～3次，有機(jī)肥隔年施用1次。

1.2 種實(shí)形態(tài)觀察及生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

本研究在香榧種實(shí)膨大期的不同階段，分別于種實(shí)突破種鱗后的30 (5月1日)、60 (6月1日)和90 d時(shí) (7月1日)進(jìn)行香榧種實(shí)樣品采集。選取長(zhǎng)勢(shì)一致、掛果良好的3株香榧實(shí)驗(yàn)樹(shù)，分別于東、南、西、北方向各隨機(jī)采集香榧種實(shí)10粒(3株樹(shù)共120粒)。香榧種實(shí)采后放置在冰盒中，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，去除有損傷的種實(shí)。部分種實(shí)用于形態(tài)觀察、拍照和含水率測(cè)定，其余種實(shí)分別取假種皮和種仁組織，切碎后立即用液氮速凍，在?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。種實(shí)橫縱徑用游標(biāo)卡尺測(cè)量，其中以種實(shí)中部橫斷面的直徑作為橫徑；單粒質(zhì)量用分析天平(0.001 g)測(cè)量，105 ℃殺青0.5 h后，置于80 ℃烘箱中烘至恒量以測(cè)定干質(zhì)量，并計(jì)算相對(duì)含水率。體積采用排水法測(cè)定。根據(jù)香榧種實(shí)橫縱徑、單粒質(zhì)量、體積變化，將香榧種實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程分為幼果期(授粉受精至翌年4月)、膨大期(5—7月)、成熟期 (7—9月)。

1.3 蔗糖、葡萄糖和果糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

蔗糖、葡萄糖、果糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照蒽酮比色法測(cè)定。

1.4 香榧種實(shí)內(nèi)源激素的測(cè)定

取0.1 g樣品，液氮研磨至粉末，置2.5 mL甲醇溶液(甲醇∶水體積比為80∶20)中，于40 ℃下萃取2 h。15 000×g離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾并用氮?dú)飧稍?，甲醇溶?甲醇與水體積比為30∶70)復(fù)溶后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(LC-MS/MS)對(duì)植物激素進(jìn)行分離和分析，使用Acquity UPLC BEH C18柱 (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)在 40 ℃ 下以 0.3 mL·min?1的流速分離樣品。IAA、GA3、GA4等質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照Z(yǔ)HAO等[23]的方法測(cè)定。

1.5 糖代謝相關(guān)酶活性測(cè)定

蔗糖磷酸合成酶和細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶參照NIELSEN等[24]和LOWELL等[25]的方法提取和測(cè)定。液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性參照TANG等[26]的方法測(cè)定。酶活性單位為μmol·mg?1·min?1。

1.6 香榧種實(shí)轉(zhuǎn)錄組分析

使用RNAprep植物總RNA提取試劑盒(中國(guó)北京天根生化)提取各個(gè)發(fā)育階段種仁的總RNA。使用 NanoDrop ND-1000分光光度計(jì) (NanoDrop Technologies Inc.，美國(guó))和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA 的濃度和質(zhì)量。每個(gè)樣品使用 3 μg RNA構(gòu)建cDNA 文庫(kù)，利用 Illumina Hi Seqogies平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾去除低質(zhì)量序列后，利用軟件Trinity v.6.0組裝mRNA序列，并使用美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)非冗余蛋白質(zhì)序列(Nr，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，NCBI非冗余核苷酸序列(Nt，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，瑞士蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(SwissProt，http://www.uniprot.org/)，同源蛋白質(zhì)簇 (COG, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)，京都基因和基因組百科全書(shū) (KEGG, http://www.genome.jp/kegg/)和GO數(shù)據(jù)庫(kù)(GO, http://www.geneology.org/)進(jìn)行單基因簇(unigene)的功能注釋。利用FPKM法計(jì)算基因虛擬表達(dá)量，差異表達(dá)基因(differentially expressed gene, DEG)應(yīng)滿足差異倍數(shù)|log2A|≥2[A表示差異倍數(shù)或變化倍數(shù)(flod change)]、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率[false discovery rate(FDR)]≤0.001、樣本間的差異由抽樣誤差所致的概率小于0.05 (P＜0.05)等條件，并通過(guò)GO和KEGG途徑富集分析差異表達(dá)基因的功能。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析，所有數(shù)據(jù)均是至少3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；采用SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性和相關(guān)性分析，并利用Cytoscape 3.0軟件構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧種實(shí)膨大過(guò)程中形態(tài)及生長(zhǎng)指標(biāo)變化

由圖1可知：香榧種實(shí)膨大過(guò)程可分為3個(gè)階段，分別是種實(shí)突破種鱗后的0～30、30～60和60～90 d，其中，種實(shí)突破種鱗后的30～60 d是香榧種實(shí)質(zhì)量和體積增大的關(guān)鍵時(shí)期。這一階段種實(shí)橫徑、縱徑、單粒質(zhì)量和體積都明顯增大，種仁從半透明狀逐漸固化變白，面積占據(jù)整個(gè)種實(shí)的絕大部分(圖1A～C)。種實(shí)突破種鱗后的60～90 d是香榧種實(shí)內(nèi)部種仁固化的重要階段。這一階段形態(tài)上，中種皮結(jié)構(gòu)更為明顯，種仁進(jìn)一步固化充實(shí)；種實(shí)大小(橫徑、縱徑)、單粒質(zhì)量、體積雖然仍在增大，但趨勢(shì)緩慢；種實(shí)突破種鱗后90 d時(shí)，種實(shí)大小和質(zhì)量均與種實(shí)突破種鱗后60 d時(shí)，相差不大(圖1A～C)。然而，香榧種實(shí)膨大過(guò)程中假種皮和種仁含水率變化有較大差異，假種皮含水率從種實(shí)突破種鱗后30～90 d呈緩慢上升至平穩(wěn)趨勢(shì)，而種仁含水率則逐漸下降，尤其是種實(shí)突破種鱗后60 ～90 d含水率顯著(P＜0.05)降低 (圖 1D)。

圖1 香榧種實(shí)膨大期生長(zhǎng)指標(biāo)變化Figure 1 Changes of growth indexes during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion stages

2.2 種實(shí)膨大期糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及相關(guān)代謝酶活性變化

香榧種實(shí)膨大過(guò)程中，蔗糖、葡萄糖、果糖以及淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在假種皮和種仁中變化顯著(P＜0.05)，且假種皮和種仁間各物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)不同(圖2)。種實(shí)突破種鱗后30～90 d，假種皮中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從 49.70 mg·g?1上升至 75.83 mg·g?1，隨后又下降至 57.14 mg·g?1；種仁中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)則持續(xù)下降，在種實(shí)突破種鱗后 60～90 d 下降明顯，從 82.89 mg·g?1下降至 55.82 mg·g?1(圖 2A)。隨著香榧種實(shí)的膨大，葡萄糖和果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在假種皮中同樣先上升后下降，至種實(shí)突破種鱗后90 d時(shí)分別為5.90和37.0 mg·g?1；種仁中兩者質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著下降(P＜0.05)，從種實(shí)突破種鱗后60～90 d階段下降了約50% (圖2B～C)。假種皮中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，從種實(shí)突破種鱗后30 d時(shí)的462.07 mg·g?1下降到 90 d 時(shí)的 254.05 mg·g?1，種仁中淀粉則在種實(shí)突破種鱗后 90 d 時(shí)顯著積累(P＜0.05) (149.72 mg·g?1)，為 30 d 時(shí)的 1.5 倍 (圖 2D)。

圖2 香榧種實(shí)膨大期蔗糖(A)、葡萄糖(B)、果糖(C)和淀粉(D)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Figure 2 Changes of sucrose (A), glucose (B), fructose (C) and starch (D) contents in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion

蔗糖代謝相關(guān)酶活性分析發(fā)現(xiàn)：香榧種實(shí)膨大過(guò)程中，蔗糖磷酸合成酶在假種皮中一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，酶活性從 0.46 μmol·mg?1·min?1升高至 1.16 μmol·mg?1·min?1，種仁中蔗糖磷酸合成酶活性則逐漸下降，種實(shí)突破種鱗后 90 d時(shí)的活性?xún)H為種實(shí)突破種鱗后 30 d時(shí)的28.82%(圖3A)。參與蔗糖水解的細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶隨著種實(shí)的膨大在假種皮中均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，酶活性最大值分別為21.91、23.49以及4.93 μmol·mg?1·min?1，而三者在種仁中的活性均有所下降，其中細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性在種實(shí)突破種鱗后30～60 d無(wú)顯著差異，而從種實(shí)突破種鱗后 60～90 d 顯著下降 (P＜0.05)，分別為 3.69和 4.63 μmol·mg?1·min?1，細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性則持續(xù)下降，至種實(shí)突破種鱗后 90 d 時(shí)，活性?xún)H 0.97 μmol·mg?1·min?1(圖 3B～D)。

圖3 香榧種實(shí)膨大期蔗糖磷酸合成酶(A)、細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶(B)、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶(C)和細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶(D)活性變化Figure 3 Changes of sucrose phosphate synthase (A), cell wall invertase (B), vacuolar invertase (C) and cytoplasmic invertase (D) activities in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion

2.3 種實(shí)膨大期內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化分析發(fā)現(xiàn)：隨著香榧種實(shí)膨大，假種皮中GA4、GA3、水楊酸(SA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈現(xiàn)顯著積累，并在種實(shí)突破種鱗后90 d時(shí)達(dá)到最高值，分別為種實(shí)突破種鱗后30 d時(shí)的2、11和8倍，而IAA、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和茉莉酸異亮氨酸(JA-ILE)質(zhì)量分?jǐn)?shù)則顯著降低(P＜0.05)(表1)。此外，乙烯前體物質(zhì)—1-氨基-環(huán)丙烷羧酸(ACC)和多種細(xì)胞分裂素(DHZ、tZR、IP等)質(zhì)量分?jǐn)?shù)也顯著下降(P＜0.05)。種仁中，GA3、SA、ABA也隨著種實(shí)膨大逐漸積累，其中ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為922.31 ng·g?1。而GA4、IAA、JA、JA-ILE和絕大多數(shù)細(xì)胞分裂素[DHZ、tZR、IP、反式玉米素(tZ)]質(zhì)量分?jǐn)?shù)則顯著降低(P＜0.05) (表1)。

表1 香榧種實(shí)膨大期內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化分析Table 1 Analysis of endogenous hormone contents in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion

2.4 種實(shí)膨大期糖代謝及激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：假種皮中葡萄糖、果糖、淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及蔗糖代謝相關(guān)酶與種實(shí)大小密切相關(guān)，其中葡萄糖、果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與種實(shí)橫、縱徑，單粒質(zhì)量和含水率呈正相關(guān)關(guān)系，與淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)則呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖磷酸合成酶均與種實(shí)大小正相關(guān)(圖4A)。同時(shí)，假種皮中蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶及細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性變化呈正相關(guān)，而淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與葡萄糖、果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶及蔗糖磷酸合成酶活性均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖4A)。與激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)激素(GA3、IAA、JA、ACC、DHZ、TZR等)與蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及各種糖代謝酶活性呈負(fù)相關(guān)，與種實(shí)大小也表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖4A)。

隨著香榧種實(shí)膨大，種仁中蔗糖、葡萄糖、果糖與淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖磷酸合成酶活性呈正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與香榧種實(shí)單粒質(zhì)量和體積也呈正相關(guān)關(guān)系(圖4B)。與激素的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：GA4和IAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和4種蔗糖代謝酶活性呈正相關(guān)，而與淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)(圖4B)。此外，多種激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與種仁含水量呈正相關(guān)，SA與種實(shí)單粒質(zhì)量和體積也呈正相關(guān)關(guān)系(圖4B)。

圖4 香榧種實(shí)膨大期假種皮(A)和種仁(B)中各生長(zhǎng)指標(biāo)、糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶活性和激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)間相關(guān)性分析Figure 4 Correlation analysis of growth index, sugar content, enzyme activity and hormone content in aril (A) and kernel tissues (B) during T.grandis ‘Merrillii’ seed expansion

2.5 種實(shí)膨大期糖代謝相關(guān)酶基因表達(dá)分析

為了深入分析香榧種實(shí)膨大過(guò)程中，蔗糖代謝、淀粉代謝以及激素信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)情況及其相互調(diào)控與種實(shí)的膨大關(guān)系等，本研究對(duì)各膨大階段的香榧種實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)：與種實(shí)突破種鱗后30 d相比，在種實(shí)突破種鱗后60 d時(shí)共鑒定到12 346個(gè)差異表達(dá)基因，其中，5 456個(gè)上調(diào)表達(dá)，6 884個(gè)下調(diào)表達(dá)。與種實(shí)突破種鱗后30 d相比，種實(shí)突破種鱗后90 d時(shí)共鑒定到22 668個(gè)差異表達(dá)基因，包括10 569個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和12 099個(gè)下調(diào)表達(dá)基因(圖5A)。KEGG代謝途徑富集分析發(fā)現(xiàn)：在前20個(gè)被顯著富集的代謝途徑中，淀粉和蔗糖代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑均被顯著富集(圖5B)。

圖5 香榧種實(shí)膨大期差異表達(dá)基因(A)及KEGG代謝途徑富集(B)分析Figure 5 Analysis of differential expression genes (A) and KEGG pathway enrichment (B) during T.grandis ‘Merrillii’ seed expansion

進(jìn)一步差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)：36個(gè)單基因簇參與香榧種實(shí)中蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)、合成和水解過(guò)程；16個(gè)單基因簇參與淀粉的合成與分解過(guò)程(圖6A)。其中，蔗糖合成酶編碼基因隨著香榧種實(shí)膨大表達(dá)量逐漸降低(圖6B)；蔗糖結(jié)合蛋白 (sucrose-binding protein，SBP)和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (sucrose transport protein，SUT)呈明顯上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但參與蔗糖及葡萄糖和果糖運(yùn)輸?shù)奶寝D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sugar transporter sweet，Sweet)基因呈下調(diào)表達(dá)(圖6B)。此外，參與蔗糖水解的細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶其編碼基因隨著香榧種實(shí)膨大既有上調(diào)又有下調(diào)情況。參與淀粉合成的可溶性淀粉合成酶 [soluble starch synthase (SSS)]、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶 [granule-bound starch synthase (GBSS)]、淀粉分支酶[starch branching enzyme (SBE)]和異淀粉酶[isoamylase (ISA)]基因表達(dá)量均隨著香榧種實(shí)膨大而呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)(圖6B)；參與淀粉水解的α-淀粉酶(alpha-amylase，AMY)和β-淀粉酶(betaamytase，BAM)香榧種實(shí)膨大過(guò)程中則分別上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)。

圖6 香榧種實(shí)膨大過(guò)程中蔗糖代謝途徑(A)及相關(guān)基因表達(dá)(B)分析Figure 6 Sucrose metabolism pathway (A) and the relative gene expression (B) analysis during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion

3 討論

香榧種實(shí)從授粉到成熟跨2 a，歷時(shí)17個(gè)月之久，其雌球花4月開(kāi)花授粉，9月完成受精，形成的幼果對(duì)生并包裹在種鱗中。次年4月，幼果開(kāi)始啟動(dòng)細(xì)胞分裂和膨大，5—7月進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，種實(shí)橫徑、縱徑、單粒質(zhì)量和體積都明顯增大，種仁逐漸固化，含水率降低。這一時(shí)期的變化是香榧種實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要基礎(chǔ)，但由于各種內(nèi)外因素的影響，絕大部分香榧幼果在種實(shí)膨大期生長(zhǎng)緩慢，甚至停止生長(zhǎng)，嚴(yán)重制約香榧產(chǎn)量。研究[27]已經(jīng)證實(shí)：處于膨大期前的香榧幼果授粉受精狀況良好，發(fā)育正常。因此，香榧種實(shí)發(fā)育過(guò)程中某些重要生理過(guò)程的變化是影響香榧種實(shí)膨大的關(guān)鍵因素，對(duì)這些生理過(guò)程的研究也是提高香榧產(chǎn)量的必要前提。

蔗糖作為光合同化物的主要積累形式，其在果實(shí)中積累后會(huì)被分解為葡萄糖和果糖。這些小分子還原糖進(jìn)一步參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等過(guò)程，為果實(shí)早期發(fā)育和細(xì)胞膨大提供能量和碳骨架[6]。同時(shí)，蔗糖水解產(chǎn)物也會(huì)進(jìn)一步合成淀粉，以淀粉形式儲(chǔ)藏[28]。有報(bào)道表明：在蠶豆Vicia faba種實(shí)發(fā)育過(guò)程中，葡萄糖可能調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，而蔗糖則調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)張和儲(chǔ)備物沉積[29]。菠蘿Ananas comosus幼果期蔗糖含量呈下降趨勢(shì)，蘋(píng)果Malus sieversii果實(shí)發(fā)育前期果糖和蔗糖含量較低[30]；咖啡Coffea racemosa果實(shí)果皮和胚乳之間存在密切的蔗糖運(yùn)輸，并且果皮中可溶性糖和還原糖含量隨著果實(shí)發(fā)育逐漸降低[31]。本研究發(fā)現(xiàn)：香榧假種皮中的蔗糖、葡萄糖、果糖隨著種實(shí)膨大先上升后下降，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷下降；種仁中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)則持續(xù)下降，淀粉逐漸積累。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：假種皮中葡萄糖、果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與種實(shí)橫縱徑顯著正相關(guān)，與淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著負(fù)相關(guān)，種仁中各種糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與種實(shí)體積顯著負(fù)相關(guān)，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與種實(shí)體積正相關(guān)。以上結(jié)果表明：膨大前期香榧假種皮中的蔗糖以積累為主，而在種實(shí)膨大后期蔗糖和淀粉主要以分解為主，以滿足種實(shí)的不斷發(fā)育；種仁中蔗糖則一直以分解為主，供給香榧種實(shí)膨大和淀粉積累。

蔗糖代謝及其相關(guān)酶活性和基因表達(dá)量的高低是衡量果實(shí)庫(kù)競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，與果實(shí)大小和產(chǎn)量密切相關(guān)，但不同植物果實(shí)中起主導(dǎo)作用的酶不同。研究發(fā)現(xiàn)：蜜柑果實(shí)膨大期液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較高，蔗糖含量隨著液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性下降而逐漸積累[15]。較高活性的細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶則有利于番茄和龍眼Dimocarpus longan果實(shí)發(fā)育過(guò)程中糖向果實(shí)中的分配及代謝過(guò)程[32?34]。梨Pyrus spp. 果實(shí)中蔗糖合成酶活性和蛋白質(zhì)含量在發(fā)育期的梨果實(shí)中明顯增加，催化蔗糖的分解代謝和果實(shí)干物質(zhì)積累，促進(jìn)果實(shí)增大[35]。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和蔗糖磷酸合成酶基因的上調(diào)表達(dá)對(duì)蘋(píng)果果實(shí)發(fā)育至關(guān)重要[33]。本研究中，隨著香榧種實(shí)膨大，蔗糖磷酸合成酶在假種皮中活性上升，而在種仁中活性下降，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性在香榧假種皮中也顯著上升。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與3種蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖磷酸合成酶活性顯著相關(guān)。結(jié)合基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：參與蔗糖及還原糖運(yùn)輸?shù)腟BP和SUT在種實(shí)膨大過(guò)程中顯著上調(diào)表達(dá)，參與蔗糖水解的細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因部分轉(zhuǎn)錄本也隨著種實(shí)膨大顯著上調(diào)，而細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶編碼基因則明顯下調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步表明香榧種實(shí)膨大過(guò)程中假種皮和種仁之間，以及種仁內(nèi)部存在活躍的碳水化合物運(yùn)輸和代謝過(guò)程，且負(fù)責(zé)蔗糖水解的酶主要是蔗糖轉(zhuǎn)化酶，細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶起到重要作用。同時(shí)，在種實(shí)膨大后期，種仁中參與淀粉合成的SSS、GBSS、SBE均顯著上調(diào)表達(dá)，參與淀粉水解的ISA、AMY上調(diào)表達(dá)，BAM下調(diào)表達(dá)。上述結(jié)果表明：香榧種實(shí)膨大早期，蔗糖分解代謝活躍，主要用于香榧種實(shí)的快速膨大；膨大后期蔗糖代謝的同時(shí)伴隨淀粉合成，有利于種實(shí)成熟過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化積累干物質(zhì)。

此外，果實(shí)內(nèi)部蔗糖代謝與激素含量變化存在顯著互作關(guān)系，共同調(diào)控果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育[36]。草莓Fragaria ananassa果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，蔗糖可作為信號(hào)分子，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ABA合成途徑基因NCEDs的表達(dá)，促進(jìn)ABA的積累[37]。番茄果實(shí)發(fā)育早期，果實(shí)中生長(zhǎng)素積累有利于蔗糖向果實(shí)中運(yùn)輸及代謝[38]。N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲 (N-(2-chloro-4-pyridyl)-N′-phenylurea, CPPU)處理后的獼猴桃 Actinidia chinensis var. deliciosa‘Hayward’果實(shí)通過(guò)增加含水率，促進(jìn)果實(shí)膨大[39]。1.25 mmol·L?1GA 處理能夠顯著增加桃果實(shí)大小以及蔗糖含量[40]。本研究發(fā)現(xiàn)：香榧種實(shí)膨大過(guò)程中，假種皮中GA4、GA3、SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈顯著積累模式，種仁中GA3、SA、ABA也隨著種實(shí)膨大逐漸積累。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：種仁中GA和IAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和4種蔗糖代謝酶活性顯著正相關(guān)，表明香榧種實(shí)膨大過(guò)程中種仁內(nèi)部激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化與糖代謝密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組代謝途徑富集顯示：激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蔗糖代謝通路在香榧種實(shí)膨大過(guò)程中均被顯著富集。結(jié)合基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：香榧種實(shí)膨大過(guò)程中伴隨GA3和GA4等激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)，表明這些基因的表達(dá)可能受到種實(shí)內(nèi)部激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的調(diào)控。與之相似，外源GA處理增強(qiáng)了液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因VvGIN1和VvGIN2在葡萄果實(shí)中的表達(dá)，明顯提高蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性，促進(jìn)糖在果實(shí)中的積累與代謝，增加果實(shí)體積[19]。同樣，外源噴施細(xì)胞分裂素能夠有效提高逆境下番茄果實(shí)蔗糖合成酶和細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性，抑制轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白(Invertase inhibitor，INVINH)的表達(dá)，增強(qiáng)果實(shí)庫(kù)活力，促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)[41?42]。這表明香榧種實(shí)中激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化可能參與調(diào)控蔗糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)蔗糖的積累與代謝過(guò)程，提高種實(shí)庫(kù)活力，進(jìn)而調(diào)控香榧種實(shí)的膨大，但具體的調(diào)控機(jī)制仍有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)：膨大前期香榧假種皮中的蔗糖以積累為主，在種實(shí)膨大后期蔗糖和淀粉以分解為主，提供能量和碳骨架，以滿足種實(shí)的不斷發(fā)育；種仁中蔗糖則一直以分解為主，一方面供給香榧種實(shí)膨大，另一方面逐漸合成淀粉，為后期成熟過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化積累干物質(zhì)。代謝相關(guān)酶活性及基因表達(dá)分析表明：香榧種實(shí)膨大過(guò)程中假種皮和種仁之間，以及種仁內(nèi)部存在活躍的碳水化合物運(yùn)輸和代謝過(guò)程，且負(fù)責(zé)蔗糖水解的酶主要是蔗糖轉(zhuǎn)化酶，細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶起到重要作用。此外，假種皮中GA4、GA3、SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈現(xiàn)顯著積累模式，種仁中GA3、SA、ABA也隨著種實(shí)膨大逐漸積累，且與蔗糖、淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和代謝酶活性呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系，表明蔗糖代謝的增強(qiáng)可能促進(jìn)了這些激素的合成和積累，激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化進(jìn)一步調(diào)節(jié)香榧種實(shí)中蔗糖代謝活性和基因表達(dá)等。