張士昌，李亞青，張 楠，彭義峰，李孟軍

(石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院/河北省小麥工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 050041)

栽培黑麥(L.)是改善小麥重要性狀和豐富其遺傳多樣性的優(yōu)良基因供體。黑麥1R染色體短臂(1RS)取代普通小麥1B染色體短臂(1BS)形成的1BL/1RS易位系具有黑麥1RS攜帶的抗葉銹、稈銹、條銹和白粉病等抗性基因，同時具有良好的豐產(chǎn)性和適應(yīng)性。1980-2002年，中國小麥育成品種中，1BL/1RS易位系品種在全國主要麥區(qū)平均占比38%，其中北方冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)分布頻率分別為59%和42%，但因1BL/1RS易位系對加工品質(zhì)具有負(fù)向效應(yīng)，在優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種中，1BL/1RS易位系比較罕見，只有鄭麥7698、煙農(nóng)21等少數(shù)優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種為1BL/1RS易位系。一般認(rèn)為，1BL/1RS易位系加工品質(zhì)低劣的主要原因有：(1)1BS上編碼低分子量麥谷蛋白亞基的位點(diǎn)和編碼γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白的位點(diǎn)的喪失；(2)1RS上編碼40 K γ-黑麥堿和ω-黑麥堿的位點(diǎn)的導(dǎo)入。因此，改良1BL/1RS易位系加工品質(zhì)的主要途徑包括：(1)在1RS末端導(dǎo)入和位點(diǎn)；(2)降低或沉默ω-黑麥堿基因位點(diǎn)的表達(dá)；(3)導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基。

1RS上位點(diǎn)編碼40K γ-黑麥堿和ω-黑麥堿，其中，ω-黑麥堿富含谷氨酰胺，幾乎不含有半胱氨酸，分子間和分子內(nèi)無二硫鍵，可使面團(tuán)吸水性增大，持水性、穩(wěn)定性和延伸性降低，導(dǎo)致1BL/1RS易位系的烘烤和蒸煮品質(zhì)下降。降低或沉默ω-黑麥堿基因表達(dá)的主要途徑包括：(1)利用部分同源染色體配對交換，通過易位使位點(diǎn)缺失；(2)采用反義RNA或RNA干擾技術(shù)降低甚至沉默ω-黑麥堿基因的表達(dá)；(3)利用輻射誘變技術(shù)使位點(diǎn)缺失，如利用快中子輻射創(chuàng)制的衡觀35的突變體。

冬小麥品種石麥15是石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院小麥研究所選育的節(jié)水高產(chǎn)抗逆品種，但其加工品質(zhì)表現(xiàn)不佳。為了發(fā)掘其在育種和生產(chǎn)中的利用價值，本研究利用N離子束誘變技術(shù)，采用醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺電泳方法(A-PAGE)驗證篩選ω-黑麥堿表達(dá)突變株系，創(chuàng)制了一系列ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失且農(nóng)藝性狀無顯著改變的新型1BL/1RS易位系，并對這些新種質(zhì)的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀進(jìn)行分析，以期為培育優(yōu)質(zhì)抗逆1BL/1RS易位系提供新的種質(zhì)和思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

冬小麥品種石麥15 由石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院小麥研究所提供。精選石麥15小麥種子以胚向上的方式擺放在靶盤中，靶盤放置在離子注入機(jī)(UIL.0.512，TNV，俄羅斯強(qiáng)電研究所)的真空靶室中(真空度3×10Pa)進(jìn)行N束(荷能30 keV)注入，注入劑量分別為4×10N·cm和6×10N·cm。每個劑量重復(fù)3次，一次重復(fù)使用500粒種子。輻照后的小麥種子(M)點(diǎn)播種植，株距10 cm，行距30 cm，單株收獲后獲得M代。將M代種子按單株分行種植，株距10 cm，行距30 cm，每個株行隨機(jī)收獲10個單穗，單穗脫粒后獲得M代。M～M代種植方法與M代一樣，單株收獲。M代獲得ω-黑麥堿表達(dá)缺失突變穩(wěn)定株系。將M代獲得的1BL/1RS易位系種子進(jìn)行微區(qū)種植，全部收獲，用于農(nóng)藝性狀觀察和品質(zhì)分析。

1.2 方 法

1.2.1 ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體的篩選

ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體篩選采用A-PAGE技術(shù)，略有改動。每個M單穗隨機(jī)選取3粒種子，切取遠(yuǎn)胚端約1/2粒，砸碎，加入100 μL提取液(50% 2-氯乙醇，0.05%甲基綠，20%甘油)，4 ℃提取過夜；12 000 rpm離心5 min，上清液即為醇溶蛋白電泳樣品。聚丙烯酰胺膠濃度為12%，交聯(lián)度為2.5%；恒壓300 V，電泳時間2 h。染色過夜，拍照記錄。

1.2.2 1RS染色體臂的分子標(biāo)記檢測

采用植物基因組提取試劑盒(天根，北京)提取葉片DNA。引物AF1/AF4、O11B3/O11B5、Bmac0213、IAG95-1、SCSS30.2、IB-267的合成及PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR StarMix(Genstar)10 μL，引物(10 μmol·L)各1 μL，模板DNA 50～100 ng，ddHO補(bǔ)充至20 μL。所有引物均由Invitrogen公司合成。引物O11B3/O11B5是1BS特異引物；引物AF1/AF4 、Bmac0213、 IAG95-1、SCSS30.2和IB-267是1RS特異引物。引物AF1/AF4在1RS上有多個結(jié)合位點(diǎn)；引物IAG95-1、SCSS30.2、IB-267結(jié)合位點(diǎn)在位點(diǎn)靠近1RS末端一側(cè)，為1RS末端抗病基因標(biāo)記，可標(biāo)示1RS末端的存在與否。引物Bmac0213結(jié)合位點(diǎn)在位點(diǎn)靠近著絲粒一側(cè)。這些引物可反映1RS的有無和缺失區(qū)段。

1.2.3 ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體的農(nóng)藝性狀分析

ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變株系采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計進(jìn)行小區(qū)產(chǎn)量比較試驗。每個小區(qū)8行，行長10 m，行距0.15 m，3 次重復(fù)，基本苗300萬株·hm，其他管理同一般大田。產(chǎn)量及其構(gòu)成因素按李雁鳴的方法進(jìn)行。收獲前定點(diǎn)調(diào)查各小區(qū)穗數(shù)；連續(xù)取20穗，計算穗粒數(shù)；成熟期各小區(qū)全部收獲，曬干后稱重，計算千粒重和產(chǎn)量。數(shù)據(jù)分析采用DPS v3.0分析軟件進(jìn)行。

1.2.4 ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體的品質(zhì)性狀分析

ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體的品質(zhì)性狀分析在石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院品質(zhì)分析實驗室進(jìn)行。根據(jù)NY/T 1094-2006標(biāo)準(zhǔn)，采用MLU 202實驗?zāi)ブ品?；根?jù)GB/T 24899-2010標(biāo)準(zhǔn)，采用Perten 7200近紅外谷物品質(zhì)分析儀測定蛋白質(zhì)含量；根據(jù)GB/T 5506.2-2008標(biāo)準(zhǔn)，采用Perton 2200型面筋指數(shù)儀測定面粉濕面筋含量；根據(jù)GB/T14614-2006標(biāo)準(zhǔn)，采用Brabender 810110型粉質(zhì)儀測定粉質(zhì)參數(shù)。采用DPS v3.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體的鑒定

A-PAGE電泳圖譜(圖1)顯示，1BL/1RS易位系石麥15 ω-醇溶蛋白具有1RS特征條帶，而9個突變株系無此特征條帶。這表明，獲得的突變株系為ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體(圖1A)。引物AF1/AF4和引物O11B3/O11B5 擴(kuò)增結(jié)果表明，9個突變株系僅含有1RS(圖1B,C)。引物Bmac0213引物擴(kuò)增結(jié)果表明，9個突變株系在標(biāo)記Bmac0213位點(diǎn)附近缺失片段大小不同(圖1D)。引物IAG95-1、IB-267、SCSS30.2擴(kuò)增結(jié)果顯示，9個突變株系1RS末端存在差異(圖1E,F,G)。

A：ω-醇溶蛋白A-PAGE電泳圖譜；B：引物AF1/AF4 PCR擴(kuò)增結(jié)果；C：引物O11B3/O11B5擴(kuò)增結(jié)果；D：引物Bmac0213 PCR擴(kuò)增結(jié)果；E：引物IAG95-1 PCR擴(kuò)增結(jié)果；F：引物IB-267 PCR擴(kuò)增結(jié)果；G：引物SCSS30.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果；M：DNA Marker DL 2000 plus；1：石麥15；2～10：ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變株系，分別為A05、A12、A19、A22、A45、A62、A77、A89和A95；11：師欒02-1；12：ddH2O。

2.2 ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體的農(nóng)藝表現(xiàn)

從表1可以看出，9個ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變株系的株高、穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量5個農(nóng)藝性狀與石麥15均無顯著差異，這表明，ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失對突變株系的農(nóng)藝性狀沒有造成顯著影響。ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變株系之間在株高上無顯著差異，但在穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量指標(biāo)上，部分突變株系表現(xiàn)出顯著 差異。

表1 ω-黑麥堿表達(dá)缺失突變株系的農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic traits of 1BL/1RS translocation lines with ω-secalin absence

2.3 ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體的加工品質(zhì)

從表2可知，大部分ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變株系的籽粒蛋白質(zhì)含量、吸水率、濕面筋含量和面團(tuán)穩(wěn)定時間與石麥15均存在顯著差異，這表明，ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失對突變株系的加工品質(zhì)有顯著影響。面團(tuán)穩(wěn)定時間反映面團(tuán)的耐揉性，是評價面粉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變株系面團(tuán)穩(wěn)定時間為2.6～3.8 min，是石麥15的1.6～2.4倍，說明ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失顯著改善了石麥15的面粉品質(zhì)。

表2 ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變株系的加工品質(zhì)Table 2 Grain processing quality of 1BL/1RS translocation lines with ω-secalin gene absence

3 討 論

1BL/1RS易位系作為育種親本，在我國育成了一批具有影響力的小麥品種，如石4185、邯6172、矮抗58、鄭麥7698等，對于提高我國小麥抗病性、豐產(chǎn)性和穩(wěn)產(chǎn)性發(fā)揮了重要作用。近年來，隨著人們生活水平的提高，對小麥產(chǎn)品的品質(zhì)提出了更高的要求，而1BL/1RS易位系因其對小麥品質(zhì)具有負(fù)向效應(yīng)，導(dǎo)致其在小麥育種中的應(yīng)用減少。為了既充分利用1BL/1RS易位系的豐產(chǎn)抗逆特性，同時又避免其加工品質(zhì)缺陷，一些研究者利用突變體誘導(dǎo)部分同源重組、基因工程技術(shù)、輻射誘變、導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基等方法，對1BL/1RS易位系進(jìn)行了改良，期望獲得豐產(chǎn)抗逆優(yōu)質(zhì)1BL/1RS易位系。

Martin等認(rèn)為，1BL/1RS易位系面包品質(zhì)不佳的主要原因在于1RS上位點(diǎn)編碼的黑麥堿，而不在于1BS編碼的低分子量麥谷蛋白和醇溶蛋白。因此，降低或沉默1RS上位點(diǎn)的表達(dá)是利用1BL/1RS易位系培育高產(chǎn)抗病優(yōu)質(zhì)小麥新品種的關(guān)鍵措施。Lukaszewski利用缺失突變體，通過誘導(dǎo) 1RS和 1BS 的部分同源重組的方法，已成功創(chuàng)制位點(diǎn)缺失的1BL/1RS易位系。晏本菊等利用不同的黑麥親本資源，獲得ω-黑麥堿基因缺失的1BL/1RS易位系。柴建芳等利用RNA干涉技術(shù)沉默了ω-黑麥堿基因的表達(dá)。以上這些途徑雖然都可以創(chuàng)制ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體，但這些方法在對1BL/1RS易位系小麥品種進(jìn)行改良時，均存在著很大的局限性。

ω-黑麥堿由位點(diǎn)上ω-黑麥堿基因家族編碼，應(yīng)用輻射誘變技術(shù)可以獲得ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變體，如王道文課題組利用快中子輻射創(chuàng)制了衡觀35的突變體。1BL/1RS易位系石麥15是一個節(jié)水高產(chǎn)品種，但其加工品質(zhì)不佳，對其推廣應(yīng)用造成不利影響。本課題組利用N離子束誘變技術(shù)創(chuàng)制了石麥15突變體群體，經(jīng)過連續(xù)田間和A-PAGE選擇獲得了ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失的1BL/1RS易位系穩(wěn)定株系。N離子束誘變對小麥農(nóng)藝性狀具有不利影響，但經(jīng)過田間對ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變株系的農(nóng)藝性狀進(jìn)行多代選擇，克服了輻射誘變對農(nóng)藝性狀的負(fù)向效應(yīng)。雖然ω-黑麥堿基因表達(dá)缺失突變株系1RS上缺失片段大小不同以及部分突變株系1RS末端缺失，但其加工品質(zhì)均得到了改良。目前，我們正在開展以下工作：(1)利用缺失突變體在1RS末端導(dǎo)入/位點(diǎn)；(2)利用分子標(biāo)記技術(shù)，通過常規(guī)雜交導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)高分子量麥谷蛋白亞基。我們期待通過以上工作進(jìn)一步提高1BL/1RS易位系加工品質(zhì)，創(chuàng)制出豐產(chǎn)抗逆優(yōu)質(zhì)1BL/1RS易位系。