王苗苗，袁曉波，李 靜，王曉騰，張 莉，李永春

(河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室，河南鄭州 450046)

干旱、高鹽等滲透脅迫是限制小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要逆境因子，探討小麥滲透脅迫響應(yīng)的生理和分子機制對于開展小麥抗逆分子育種具有重要意義。近年來大量研究表明，microRNAs(miRNAs)作為一類非編碼小RNA(長度在21～24 nt之間)，參與植物生長發(fā)育調(diào)控、逆境脅迫響應(yīng)等多個生理調(diào)節(jié)過程，有關(guān)miRNA參與的逆境脅迫響應(yīng)調(diào)控機制已成為植物抗逆分子機理研究的重要領(lǐng)域，特別是miRNA作為抗逆分子育種的重要靶標也日益受到重視。對模式植物擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，miR169參與干旱響應(yīng)的分子調(diào)節(jié)過程，過表達轉(zhuǎn)基因材料的耐鹽能力顯著提高。說明miRNA在植物的非生物脅迫應(yīng)答中具有重要的調(diào)控作用。對其他作物研究發(fā)現(xiàn)，miR172和miR396與馬鈴薯的脯氨酸合成調(diào)控及干旱脅迫響應(yīng)密切相關(guān)，推測這兩個miRNA可能參與了脯氨酸合成過程中關(guān)鍵基因的表達調(diào)控；過表達轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽能力降低，推測該miRNA參與了氣孔發(fā)育及鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)控過程；玉米miR169也與干旱高鹽脅迫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在小麥中，Shi等發(fā)現(xiàn)，miR1119參與了抗旱調(diào)控過程；Bai等發(fā)現(xiàn)，miR408對于耐鹽生理調(diào)節(jié)至關(guān)重要。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小麥在種子脫水過程中迅速上調(diào)表達；在此基礎(chǔ)上，本研究進一步分析了的序列特征及其對干旱和高鹽脅迫的響應(yīng)模式，以期為探討的功能及其在小麥育種中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

試驗所用小麥(L.)品種包括中國春和矮抗58，種植于河南農(nóng)業(yè)大學原陽試驗基地。種子形成過程中，剝?nèi)∈诜酆蟮?、10、15、20、25和30 d的籽粒，用于分析小麥的特征；取三葉期的根和葉片，開花期的節(jié)間、節(jié)、穗下節(jié)、旗葉，以及成熟期的籽粒，用于組織表達特性分析。脅迫處理過程如下：首先，選取飽滿一致的小麥種子用NaClO(10%)表面消毒；然后，在人工氣候室[溫度為24 ℃(光照)和18 ℃(黑暗)，每天光照16 h，光照強度240 mmol·m·s]水培至兩葉一心期時進行脅迫處理。模擬干旱脅迫采用PEG6000(20%)處理，模擬鹽脅迫采用NaCl溶液(150 mmol·L)處理，分別剪取脅迫處理0、0.5、1、2、6、12、24、48 h的根和葉，用于分析脅迫下的表達量。上述試驗均設(shè)3個生物學重復，所有組織用液氮速凍置于-80 ℃保存、備用。

1.2 RNA和DNA的提取

籽粒總RNA采用Trizol Plant試劑盒(全式金，北京)提取，其余組織總RNA采用RNAisoPlus試劑盒(Tarkara，日本)；RNA反轉(zhuǎn)錄采用TransScript miRNA First-strand cDNA Synthesis Supermix試劑盒(全式金，北京)，合成的cDNA于-80 ℃保存，備用；基因組DNA采用CTAB法提取。

1.3 基因片段的克隆及序列分析

用小麥基因組數(shù)據(jù)庫Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)對小麥miR154序列(5′-GGCGAGGGACAUACACUGUACA-3′)進行比對分析，確定基因位點。候選基因序列下載后利用SnapGene軟件進行3個部分同源基因序列比對分析，用RNA Folding Form(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/rna-folding-form)對RNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)進行分析，用Primer 5.0軟件設(shè)計引物?？寺〉奶禺惿嫌我餅閅P2093(5′-ATTGTGAACTCCAAGTGGCATG-3′)，下游引物為YP2095(5′-GGTTGTGTTGCTGTGCTCGATC-3′)，用高保真酶LA Taq以基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增體系為20 μL，包括10×LA PCR Buffer Ⅱ 2.0 μL,dNTP mix solution 1.8 μL,TaKaRa LA Taq Enzyme 0.2 μL,Template 1.0 μL,YP2093和YP2095引物(10 μmol·L)各1.0 μL,ddHO 13 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min 30 s,72 ℃延伸25 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存?？寺∑芜B接到pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用載體通用引物YP0085(5′-ATCGGTGCGGGCCTCTT-3′)和YP0086(5′-GGCACCCCAGGCTTTACAC-3′)進行重組克隆，每個品種隨機挑選5個克隆進行測序分析。

1.4 表達模式分析

用RT-qPCR的方法進行實時定量表達分析，反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA模板1 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，uni prime (10 μmol·L) 0.4 μL，specific prime (10 μmol·L) 0.4 μL，RNase-free水 8.2 μL。其中，uni primer為全式金試劑盒提供的通用引物，specific primer為YP0949(5′-GGCGAGGGACATACACTGTACA-3′)。做熒光定量時，使用試劑盒中的通用引物是由于miRNA的特殊性，miRNA序列很短，miR154成熟序列僅為22 nt，所以在反轉(zhuǎn)錄時進行了Ploy(A)加尾，在測定的表達量時，上游使用特異引物YP0949(5′-GGCGAGGGACATACACTGTACA-3′)，下游使用通用引物。熒光定量PCR儀型號為Bio-Rad伯樂CFX Connect。每個反應(yīng)設(shè)定3次重復，采用兩步法PCR，反應(yīng)程序： 94 ℃預變性30 s,94 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。內(nèi)標為snRNA U6，引物為YP1303(5′-CCTTCGGGGACATCCGATAAA-3′)和YP1304(5′- ATTTGGACCATTTCTCGATTTGTGC-3′)。實時定量數(shù)據(jù)分析采用2-△△法計算，并用Excel 2003作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥Ta-miR154的特征分析

用Ensembl Plants對miR154序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)基因位于第7同源群染色體上，將其在A、B、D基因組上的3個部分同源基因分別命名為、和。采用特異引物YP2093和YP2095對中國春和矮抗58兩個小麥品種的基因組DNA進行擴增，兩個品種均獲得了約1 000 bp和1 500 bp的兩個片段(圖1A)。將上述兩個片段分別連接到PMD19-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，每個片段隨機挑選5個重組克隆，利用A、B、D基因組特異引物進行鑒定并測序。測序結(jié)果顯示，中國春三個部分同源基因、和間的序列存在較大差異。與(993 bp)相比，(1 011 bp)和(1 529 bp)分別存在70(63個SNP和7個InDel)和55(50個SNP和5個InDel)個差異位點；矮抗58和中國春兩個品種間的miRNA前體區(qū)域序列高度保守，其中、、和分別存在12、15和5個SNP差異；在生成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)域兩個品種間序列完全一致(圖1B)，和分別僅存在1個SNP差異，而與另兩個部分同源基因間存在4個SNP差異，特別是第32位的C/T變異使得其無法生成。RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)分析顯示，3個部分同源基因產(chǎn)生的miRNA前體均可形成典型的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但由于和間2個單核苷酸的差異導致發(fā)夾結(jié)構(gòu)頂端的2個折疊環(huán)大小存在一定差異(圖1C)。

A： Ta-MIR154的克隆結(jié)果，M: DL2000；1：中國春；2：矮抗58。B： Ta-MIR154三個部分同源基因間的序列比對。C：RNA二級結(jié)構(gòu)分析，紅色圓圈標記區(qū)域為成熟miRNA對應(yīng)區(qū)域。A: Cloning results of Ta-MIR154, M: DL2000; 1: Chinese Spring; 2: Aikang 58.B: Sequence alignment among the three homologues of Ta-MIR154 genes.C: Secondary RNA structures of Ta-MIR154 gene,and sequences marked with red circles are regions corresponding to the mature miRNAs.圖1 小麥 Ta-MIR154基因的克隆及序列特征分析Fig.1 Cloning and sequence characterization of Ta-MIR154 gene in wheat

2.2 小麥不同組織中 Ta-MIR154的表達模式 分析

對的組織表達特性進行分析，結(jié)果(圖2A)發(fā)現(xiàn)，不同組織的表達模式存在明顯差異?？傮w來看，在成熟種子中的表達量最高，其次為節(jié)間和根系組織，而在穗下節(jié)、節(jié)和葉片中的表達量較低；在兩個品種間的表達水平呈現(xiàn)相似的變化趨勢，但矮抗58的表達水平略高于中國春。進一步分析兩品種籽粒發(fā)育過程中的表達模式，發(fā)現(xiàn)在籽粒發(fā)育早期的表達量均較低，而在授粉后20 d表達量迅速上升，授粉后30 d表達量達到最大值。

A: 不同組織中 Ta-MIR154的表達分析；B：籽粒形成過程中 Ta-MIR154的表達分析。RO：根系；IN：節(jié)間；PE：穗下節(jié)；NO：節(jié)；LE：葉；FL：旗葉；MG：成熟籽粒。圖柱上的**表示品種間差異極顯著(P<0.01)。A: Expression of Ta-MIR154 in different wheat tissues;B:Expression of Ta-MIR154 during grain development.RO:Root;IN:Internode; PE: Peduncle;NO:Node;LE:Leaf;FL:Flag leaf;MG:Mature grain.** on the columns indicate significant difference between varieties at 0.01 level.圖2 小麥不同組織中 Ta-MIR154的相對表達量Fig.2 Expression of Ta-MIR154 in different wheat tissues

2.3 干旱脅迫對小麥 Ta-MIR154相對表達量的影響

為探討對干旱脅迫的響應(yīng)模式，利用qRT-PCR技術(shù)分析PEG6000(20%)處理條件下小麥葉片和根系中的表達模式。結(jié)果(圖3)顯示，隨著干旱脅迫時間的延長，中國春小麥葉片中的相對表達量總體上呈上升趨勢，特別是脅迫6 h后，上調(diào)表達幅度逐漸增加，脅迫24和48 h時的相對表達量分別約為脅迫0 h的6倍和14倍，差異均達極顯著水平；矮抗58葉片中的相對表達量受脅迫誘導后快速上升，且整體上其表達水平要高于中國春(圖3A)，脅迫2、24和48 h的表達量與0 h之間差異均達極顯著水平，推測在葉片中的積累與其抗旱調(diào)節(jié)能力的增強有關(guān)。隨著干旱脅迫時間的延長，中國春根系中的相對表達量呈先上升后下降的變化趨勢，脅迫12 h時的相對表達量最高，約為脅迫0 h的8倍，脅迫12和24 h時的表達量與0 h之間差異均達極顯著水平；而矮抗58根系中的相對表達量呈先降低后上升的變化趨勢，且整體表達水平低于中國春(除脅迫48 h外)(圖3B)，脅迫48 h的表達量與0 h之間差異達極顯著水平。在所檢測的兩個品種間呈現(xiàn)出不同的干旱響應(yīng)模式，可能與品種的抗旱特性差異有關(guān)。

A: 葉片中 Ta-MIR154的表達分析；B：根系中 Ta-MIR154的表達分析。**表示該品種 Ta-MIR154的相對表達量在該脅迫時間與0 h之間差異達極顯著水平(P<0.01)。圖4同。A: Expression of Ta-MIR154 in leaves; B:Expression of Ta-MIR154 in roots.** indicates significant difference of the expression of Ta-MIR154 in the variety between the corresponding stress time and 0 h(P<0.01).The same in figure 4.圖3 干旱脅迫條件下 Ta-MIR154的表達分析Fig.3 Expression of Ta-MIR154 under drought stress

2.4 鹽脅迫對小麥 Ta-MIR154相對表達量的 影響

鹽脅迫條件下，兩個小麥品種間葉片和根系中的表達模式均存在較大差異(圖4A)。隨鹽脅迫時間的延長，中國春葉片中的相對表達量呈先上升后下降的變化趨勢，脅迫24 h時的表達量最高，約為脅迫0 h的17倍，脅迫2～24 h的表達量與0 h之間差異均達極顯著水平；而矮抗58葉片中的相對表達量在各脅迫時間與0 h之間均無顯著差異。中國春根系中的相對表達量在各脅迫時間與0 h之間也均無顯著差異；而矮抗58根系中的相對表達量呈升-降-升的變化趨勢，脅迫2 h時的表達量最高，約為脅迫0 h的12倍，差異達極顯著水平(圖4B)。推測在小麥響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮一定的功能，且其參與的鹽脅迫調(diào)控機制在品種間存在一定差異。

圖4 鹽脅迫條件下 Ta-MIR154的表達分析Fig.4 Expression of Ta-MIR154 under salt stress

3 討 論

小麥是典型的異源六倍體植物，含有A、B和D部分同源的3個基因組，大多數(shù)基因在小麥基因組中均存在3個部分同源的基因成員。因此，小麥基因組中廣泛存在基因冗余現(xiàn)象，而且部分同源基因間往往具有功能互補的特性。本研究中，、和基因序列間存在一定差異，特別是在成熟miRNA對應(yīng)位置由于一個核苷酸的差異導致其不能生成；而和在miRNA前體區(qū)域高度相似，而且miRNA前體序列都可形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，推測和兩個基因均具有生成的能力。不過，由于和兩個基因在miRNA前體區(qū)域存在兩個堿基的差異，且導致RNA折疊后頂端兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生微小的變化，這是否會影響到成熟的生成，仍需進一步證實。

植物在抵御逆境脅迫過程中涉及到一系列的生理響應(yīng)和基因表達調(diào)控過程，已有研究表明，依賴于miRNA表達的基因在植物對逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要調(diào)控功能，Liu等研究還發(fā)現(xiàn)，依賴于miRNA的調(diào)控機制可能與小麥的脅迫記憶和跨代效應(yīng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，對干旱和高鹽脅迫的響應(yīng)模式在兩個小麥品種中不同，這可能與兩個品種具有不同的抗逆特性有關(guān)。對基因組序列分析也發(fā)現(xiàn)，該基因上游調(diào)控區(qū)包含有防御和應(yīng)激反應(yīng)元件(TC-rich repeats)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)和脅迫誘導轉(zhuǎn)錄因子MYB，進一步說明參與滲透脅迫響應(yīng)過程。另外，小麥籽粒成熟后期實際上也是一個干物質(zhì)積累和籽粒脫水的調(diào)控過程，小麥籽粒脫水特性也直接關(guān)系到籽粒機收效率和安全貯藏問題；本研究發(fā)現(xiàn)，在籽粒成熟期迅速上調(diào)表達，推測其可能與籽粒脫水調(diào)控相關(guān)。在滲透脅迫響應(yīng)過程中的調(diào)控功能仍有待進一步研究。