陳雅純，郭明珠，王利文，桑亞新，孫紀(jì)錄

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

貝類是指任何可食用的海洋無脊椎動物，包括甲殼類和軟體動物[1]。甲殼類屬于節(jié)肢動物門，有對蝦、龍蝦和螃蟹等；軟體動物屬于軟體動物門，是除節(jié)肢動物外最大的類群，有雙殼類（蛤蜊、扇貝、貽貝、牡蠣）、腹足類（蝸牛、鮑魚）和頭足類（魷魚、章魚）[2]。近年來，由貝類引起的過敏事件占所有食物過敏病例的90%以上，影響高達(dá)10.3%的總?cè)丝冢瑯?gòu)成世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[3-5]。據(jù)統(tǒng)計[6]，在亞洲貝類過敏癥的患病率普遍較高，兒童食物過敏人群中，甲殼類產(chǎn)品引發(fā)的過敏反應(yīng)占39%，魚類占13.2%；而在成人中，甲殼類和軟體類水產(chǎn)品的過敏反應(yīng)引發(fā)率分別為33.8%、18.9%。我國是貝類生產(chǎn)和消費大國，近年來由食用貝類引發(fā)的食物過敏問題日益增多，貝類過敏不同于牛奶、雞蛋等好發(fā)于嬰幼兒的致敏食物，由貝類引起的食物過敏好發(fā)于成人，易引起皮膚紅腫、鼻炎、哮喘等癥狀[7]。這種過敏不會獲得自然耐受性[8]，通常會持續(xù)終生。由此可見，貝類引發(fā)的食物過敏是需重視的食品安全問題。

目前，貝類已有多種蛋白被鑒定為食物致敏原。其中，最主要致敏原為原肌球蛋白，其他致敏原有精氨酸激酶、肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白、肌球蛋白輕鏈以及新型致敏原磷酸丙糖異構(gòu)酶、細(xì)絲蛋白C等[9]。對于貝類過敏患者來說，避免進(jìn)食相關(guān)的致敏原是預(yù)防過敏最安全有效的措施，但這使患者不能隨心享受各種食品，同時有可能導(dǎo)致營養(yǎng)成分失衡[10]。因此，消減貝類主要致敏原致敏性技術(shù)對過敏人群和食品工業(yè)至關(guān)重要。本文詳細(xì)介紹了貝類主要致敏物質(zhì)原肌球蛋白，重點整理了原肌球蛋白致敏性消減技術(shù)，并提出未來解決貝類致敏原的需求和挑戰(zhàn)，為深入研究貝類原肌球蛋白、開發(fā)低致敏或脫敏產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)，以便最大限度地開發(fā)貝類的營養(yǎng)價值，最大限度地減少過敏的不利影響。

1 原肌球蛋白概況

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）是貝類的主要致敏蛋白，廣泛存在于甲殼類水產(chǎn)品和蛤蜊、貽貝等軟體動物的肌肉或非肌肉組織中。TM是由兩個相同的α-螺旋結(jié)構(gòu)相互交織形成的超螺旋結(jié)構(gòu)，包括7個肌動蛋白結(jié)合位點，主要功能是促進(jìn)肌鈣蛋白和肌動蛋白在橫紋肌細(xì)胞中的相互作用，調(diào)節(jié)肌肉組織收縮[11]。TM是一種酸性糖蛋白質(zhì)，含有276個～284個氨基酸殘基，相對分子量為34 kDa～38 kDa，耐高溫且軟體動物的TM具有抗消化性[12]。目前，多種貝類TM已被分離鑒定出來，其中包括凡納濱對蝦（Litopenaeus Vannamei）[13]、褐美對蝦（Penaeus aztecus）[14]和太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）[15]等，分離出的致敏原TM分別命名為 Lit v 1、Pen a 1、Pen m 1、Pen b 1 和 Cra g 1 等。TM 之間的氨基酸序列同源性很高，在軟體動物中不同種類軟體動物之間TM的同源性為70%～80%，與甲殼類TM的同源性為63%～64%，以至于很多對軟體動物過敏人群在攝入甲殼類動物時也會發(fā)生過敏反應(yīng)[16-17]。貝類引起的過敏反應(yīng)屬于特異性IgE抗體介導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng)，過敏反應(yīng)機理如圖1所示。

圖1 貝類過敏反應(yīng)機理Fig.1 Mechanism of allergic reaction in shellfish

近年來，國內(nèi)外研究學(xué)者不斷改進(jìn)TM純化方法，減少了復(fù)雜、耗時的層析過程。傅玲琳等[18]用硫酸銨沉淀、結(jié)合等電點、加熱的方法純化了南美白對蝦TM，經(jīng)測定其質(zhì)量濃度最高可達(dá) 43 μg/μL；Xu 等[19]研究了一種硫酸銨與等電沉淀相結(jié)合的非熱技術(shù)來提取純化魚、蝦和蛤蜊中的TM；Chinnappan等[20]利用硫酸銨沉淀法從黑虎對蝦和牡蠣中提取純化TM。

2 原肌球蛋白致敏性的消減技術(shù)

由于貝類食品過敏事件的影響，研究人員一直在尋找新的食品加工技術(shù)來消減食品的致敏性，以便貝類食品經(jīng)過適當(dāng)加工可以為過敏人群所食用。目前，用于消減TM致敏性的技術(shù)主要分為物理、化學(xué)、發(fā)酵和組合消減法。物理法，如熱處理、高靜水壓、超聲波和輻照，是研究和使用最廣泛地消除TM的食品加工方法，具有無殘留、風(fēng)味損失和質(zhì)地變化小、成本相對較低的優(yōu)點[21]；化學(xué)法，如美拉德反應(yīng)或酶法，是通過化學(xué)手段影響TM分子中的氨基、羧基、巰基和酰胺鍵等基團，改變蛋白的靜電荷、疏水基團及其空間結(jié)構(gòu)，從而影響其致敏性[10]；乳酸菌發(fā)酵法，隨著近幾年食品生物技術(shù)的發(fā)展，也越來越多地用于貝類致敏蛋白的消減；組合消減法結(jié)合多種食品加工方法，有協(xié)同或強化效果，能有效降低致敏性[22]。各種技術(shù)方法實行的關(guān)鍵因素、優(yōu)點和缺點見表1。

表1 原肌球蛋白致敏性消減技術(shù)比較Table 1 Comparison of allergenic subtraction technologies of tropomyosin

2.1 物理法

2.1.1 熱處理

熱處理是一種常見的食品加工方法，操作簡單且成本低，但TM具有熱穩(wěn)定性，傳統(tǒng)的熱處理很難降低它的致敏性，并且加熱可能產(chǎn)生新的抗原表位或使掩藏的表位暴露，使致敏性增加。如Fang等[23]通過煮沸和焙烤的方式加熱處理牡蠣主要致敏原Cra g 1（TM），結(jié)果表明加熱后的Cra g 1比對照樣品產(chǎn)生更高的IgE反應(yīng)活性，這可能是由于加熱導(dǎo)致蛋白聚合物的形成。

然而，新的熱處理方法在某些情況下是有效的，例如電介質(zhì)加熱。電介質(zhì)加熱是電磁波加熱電介質(zhì)材料的過程。根據(jù)頻率的不同，介質(zhì)加熱可分為射頻加熱（10 MHz～50 MHz）和微波加熱（＞100 MHz）。目前，只有微波被廣泛研究用于消減TM的致敏性，因為它具有更高的效率和更強的蛋白質(zhì)變性潛力[24]。利用微波加熱處理蝦蟹可降解致敏原TM，使致敏性輕微降低，但效果有限并不適合實際應(yīng)用[25]。

因此，由于TM的熱穩(wěn)定性，采用單一的熱處理對過敏原的消減效果一般，且會影響其原有的營養(yǎng)與風(fēng)味價值[26]，熱處理聯(lián)合其他消減技術(shù)可能更適合于TM的消減。熱處理使用的溫度比較極端，會破壞蛋白質(zhì)并引發(fā)不良變化，導(dǎo)致食品營養(yǎng)損失和風(fēng)味變差，所以不推薦熱處理作為消除貝類過敏原的首選方法。

2.1.2 高靜水壓

高靜水壓（high hyperbaric pressure，HHP）是一種新型的非熱脫敏技術(shù)，對貝類感官和營養(yǎng)特性的影響最小。HHP與逐漸散熱的熱處理不同，不考慮食品材料的尺寸和形狀，100 MPa～1 000 MPa的壓力以均勻的方式快速分布在整個食品中[27]。HHP只影響非共價鍵（如離子鍵、氫鍵和疏水鍵）。由于TM的一級結(jié)構(gòu)是通過共價鍵連接的氨基酸序列，它們受高壓的影響極小；而二級結(jié)構(gòu)是通過分子內(nèi)或分子間氫鍵形成α-螺旋或β-折疊的多肽鏈組成，其中氫鍵和鹽橋的斷裂會受到HHP處理的影響；HHP也極大地影響TM的三級和四級結(jié)構(gòu)，因為它們是由非共價鍵維持的[28]。TM的破壞程度取決于所施加壓力的大小[29]，采用低壓處理時，一級結(jié)構(gòu)會發(fā)生可逆性展開，二級結(jié)構(gòu)中由氫鍵引起的壓縮會導(dǎo)致蛋白構(gòu)象變化，三級結(jié)構(gòu)和其他分子間相互作用的變化發(fā)生在200 MPa，四級結(jié)構(gòu)在150 MPa～200 MPa的壓力水平下會發(fā)生變化，將壓力進(jìn)一步增加到500 MPa時蛋白質(zhì)展開形成生物大分子特有的無序結(jié)構(gòu)。

HHP能有效降低原肌球蛋白的致敏性。Jin等[30]利用HHP技術(shù)研究了新鮮魷魚TM的結(jié)構(gòu)和致敏性變化，當(dāng)壓力從200 MPa增加到600 MPa時，TM中的α-螺旋逐漸減少，在600 MPa時約有53%的α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊和無規(guī)則卷曲，根據(jù)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗得出，400 MPa和600 MPa要比200 MPa降低致敏性的效果好，并且提高了魷魚TM的消化率。李正龍[31]考察了超高壓對鰻魚原肌球蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示在 200 MPa～400 MPa壓力下，β-折疊轉(zhuǎn)化為 β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，在500 MPa和600 MPa下，α-螺旋展開轉(zhuǎn)化為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，隨著壓力強度的增加，鰻魚TM表面疏水性不斷增加，巰基含量不斷降低，這表明較高的壓力可以更顯著地改變TM結(jié)構(gòu)。由此可見，HHP通過破壞蛋白質(zhì)的弱鍵改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或失活，使TM致敏性消減，同時對食品品質(zhì)損失較小，因而，HHP是有潛力和發(fā)展前途的致敏性消減技術(shù)[32]。

2.1.3 超聲波

超聲波被定義為使用頻率大于20 kHz的聲波，根據(jù)超聲強度的不同分為高強度（低頻）超聲（＞10 W）和低強度（高頻）超聲（＜1 W）[33]，其中常用于食品加工的是高強度超聲（high intensity ultrasound，HIU）[34]。HIU是依靠介質(zhì)傳播的彈性機械波，介質(zhì)中的粒子在超聲波傳遞過程中產(chǎn)生劇烈機械振動，引起介質(zhì)間的空化和機械作用[35]，產(chǎn)生局部高壓和高溫，破壞非共價鍵，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生無序變化，導(dǎo)致致敏蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而影響致敏性。與其他物理改性技術(shù)相比，HIU能大幅度提高處理質(zhì)量、速度和效率，還有成本低、操作簡單、污染小等優(yōu)點。

HIU在消減TM致敏性的方面有著令人滿意的效果。HIU依靠處理時間來影響整個蝦提取物和原肌球蛋白的致敏性。Dong等[36]評估HIU處理對蝦樣品的理化和致敏特性的影響，發(fā)現(xiàn)致敏性隨著時間的增加而降低，并且在20 min時表現(xiàn)出最佳的降敏效果，TM減少了76%，20 min后觀察到更多的碎片、條帶和孔洞，這表明HIU對TM降解有顯著影響。Zhang等[37]探究了HIU功率的影響，15 min的條件下，功率由100 W到800 W，α-螺旋含量降低，β-折疊、β-轉(zhuǎn)彎和無規(guī)則卷曲含量增加，較強的HIU可破壞TM結(jié)構(gòu)，增強TM的胃腸道消化率，使TM和消化產(chǎn)物的致敏性降低到較低水平。PANIWNYK等[38]研究了HIU對蝦TM與IgE結(jié)合能力的影響，分別在0℃和50℃下用HIU（30 Hz，800 W）處理1.5 h，發(fā)現(xiàn)在50℃下蝦的致敏性顯著低于0℃處理和未處理的蝦，這說明超聲溫度對TM消減效果也有一定影響。因而，超聲處理的效果與功率強度、時間和控制溫度緊密相關(guān)，也有許多研究證明[39]，超聲結(jié)合酶解、加熱或美拉德反應(yīng)脫敏效果更好。

2.1.4 輻照

輻照（irradiation）是利用電離放射性輻射源60Co、137Cs產(chǎn)生的γ-射線或電子加速器產(chǎn)生的電子束對食品進(jìn)行電離輻射的過程[40]。輻照會產(chǎn)生自由基，自由基容易引起蛋白質(zhì)斷裂和聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)改變，破壞TM與IgE的結(jié)合表位[41]，從而使TM的致敏性降低。一般來說，中等劑量（1 kGy～10 kGy）常用于對易腐食品（如水果和蔬菜）進(jìn)行巴氏殺菌，當(dāng)輻照劑量高達(dá)10 kGy時，可以有效破壞過敏原的抗體結(jié)合表位。Muanghorn等[42]用60Co處理羅氏沼蝦，發(fā)現(xiàn)在10 kGy和15 kGy下，TM條帶密度明顯降低。Liu等[43]采用10 kGy劑量的電子束輻照處理蝦，結(jié)果顯示蝦TM與IgE結(jié)合能力減少約20%。Mei等[44]研究了劑量為1 kGy～9 kGy的電子束輻照對蟹肉中IgG結(jié)合能力和TM結(jié)構(gòu)的影響，隨著劑量的增加，α-螺旋含量降低，巰基含量降低，表面疏水性顯著增加。輻照能有效改變TM的二、三級結(jié)構(gòu)，受TM熱穩(wěn)定性的影響不大，安全性好，其中電子束輻射不需要使用放射性元素，比γ-射線更安全，更容易被消費者接受，目前還未有輻照處理食品產(chǎn)生有害物質(zhì)的報道，但過高劑量的輻照會使氨基酸殘基氧化、斷裂，改變生物大分子的功能完整性[45]。

2.2 化學(xué)法

2.2.1 美拉德反應(yīng)

美拉德反應(yīng)是指蛋白中的氨基（主要來自含ε-氨基的賴氨酸）與羰基（主要來自還原糖）發(fā)生的非酶促化學(xué)反應(yīng)[46]。美拉德反應(yīng)通過引入還原糖使目的蛋白增加糖鏈，進(jìn)而修飾TM上與IgE結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸表位[47]。國內(nèi)外許多研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)對TM致敏性的消減程度主要取決于所用還原糖的種類和環(huán)境條件。采用果糖和木糖與對蝦TM發(fā)生美拉德反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)TM的致敏性并沒有降低[48]，而以葡萄糖為底物會顯著降低TM的致敏性。Zhang等[49]發(fā)現(xiàn)TM與葡萄糖在37℃經(jīng)糖化反應(yīng)18 h后，α-螺旋含量大幅下降，賴氨酸的含量降低了55%，TM結(jié)構(gòu)的改變使其致敏性顯著降低。Fu等[50]利用核糖、低聚半乳糖和低聚殼聚糖與TM進(jìn)行美拉德反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)TM被糖基化后其致敏性均顯著降低，致敏性最高可降低60%。藺海鑫等[51]利用核糖與菲律賓蛤仔TM反應(yīng)12 h，產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力下降76.2%，α-螺旋含量下降了71.7%，蛋白表面疏水性增加了192%，有效賴氨酸含量降低了45.5%，試驗發(fā)現(xiàn)4 h的反應(yīng)時間就能改變菲律賓蛤仔TM的結(jié)構(gòu)，使其致敏性降低。此外，美拉德反應(yīng)過程中可能會形成新的致敏化合物或新的過敏原。Nakamura等[52]發(fā)現(xiàn)扇貝TM被葡萄糖、果糖或麥芽糖糖基化后，其與IgE抗體的結(jié)合能力增強。因此，美拉德反應(yīng)可以有效消除貝類TM，但需要選擇合適的還原糖和反應(yīng)條件（如時間、溫度）來增強其消減效果。

2.2.2 酶法

酶法是消減過敏原致敏性中應(yīng)用最為廣泛的方法。首先，蛋白酶可以將TM水解成多肽或氨基酸等小分子物質(zhì)，從而破壞其線性表位和空間結(jié)構(gòu)，降低TM致敏性[53]。Mejrhit等[54]研究發(fā)現(xiàn)TM在人工胃液中極其不穩(wěn)定，在胃蛋白酶水解作用下，IgE的結(jié)合能力下降。同時，王學(xué)麗等[55]模擬了TM的胃腸消化，采用質(zhì)譜技術(shù)分析消化產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)胃腸消化2 h后，仍存少許不被破壞的抗原表位，但胃蛋白酶破壞了TM大部分的抗原表位，有效地影響TM的致敏性。Lasekan[56]用堿性蛋白酶和植物蛋白酶處理蝦樣后發(fā)現(xiàn)只有堿性蛋白酶顯著降低了TM的IgE免疫活性。其次，TM在酶的作用下發(fā)生分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)反應(yīng)，促使TM交聯(lián)聚合，從而使抗原表位隱藏在內(nèi)部，致敏性也隨之改變[57]。Liu等[58]將辣根過氧化物酶與蟹TM交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)產(chǎn)物可改善小鼠的致敏癥狀，顯著降低其體內(nèi)的特異性IgE水平，這是因為酶可通過影響TM的結(jié)構(gòu)，改變抗原的遞呈方式，誘導(dǎo)致敏小鼠產(chǎn)生對TM的口服耐受性。當(dāng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與酪氨酸酶聯(lián)合使用時，也可顯著降低蝦TM的致敏性[59]。酶法具有高效和環(huán)保性，但也有很強的特異性，與所選酶的種類、溫度和pH值有關(guān)，單一使用酶法大多會產(chǎn)生苦味肽，對貝類食品風(fēng)味產(chǎn)生影響，組合其他技術(shù)使用效果更佳。

2.3 發(fā)酵法

乳酸菌是人體腸道中必不可少的一種有利于身體健康的益生菌，研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵可以解離蛋白物質(zhì)，破壞致敏蛋白的結(jié)構(gòu)和線性表位，導(dǎo)致致敏性隨之改變。王夢夢等[60]在37℃條件下對小龍蝦進(jìn)行發(fā)酵加工處理，結(jié)果表明TM含量和免疫活性均降低。傅玲琳等[61]通過體外實驗研究5種乳酸菌對小鼠致敏性的影響差異，發(fā)現(xiàn)其中芽孢乳酸菌09.712對小鼠的抗過敏能力最強。肖葉等[62]探究了乳酸菌（植物乳桿菌）對過敏原TM免疫活性的影響，結(jié)果表明不同提取物水解TM48 h后，植物乳桿菌各成分提取物都會較大程度改變TM的二級結(jié)構(gòu)并破壞其致敏表位，其中菌體對TM致敏性的消減率最高（76.9%），此外，研究發(fā)現(xiàn)氨基可能是植物乳桿菌消減TM致敏性的一個重要作用位點。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)[63]，乳酸菌還可以改善腸道菌群狀態(tài)，調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，增強機體對外來致敏食物的免疫力，進(jìn)而改善機體的過敏癥狀。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)法相比，發(fā)酵法在降低致敏性的同時，還能改善水產(chǎn)品的營養(yǎng)風(fēng)味。因此，對于貝類食物過敏癥患者來說，食用發(fā)酵食品是一種較好的選擇。

2.4 組合消減法

單一的先進(jìn)加工技術(shù)雖然是直接消除貝類食品致敏性的方法，但是多種方法的組合可以彌補單一加工技術(shù)處理的不足，使消減效果得到強化。此外，組合消減法還需要盡可能地實現(xiàn)防止食品質(zhì)地、營養(yǎng)、風(fēng)味遭到破壞和保障食品質(zhì)量安全的目標(biāo)。表2整理了近幾年有關(guān)TM的組合消減研究。

表2 組合消減法對貝類TM影響的研究Table 2 Study on the effect of combinatorial subtraction on shellfish TM

3 展望

隨著由誤食貝類引發(fā)的食物過敏問題日益增多，人們對過敏性疾病越來越重視，有關(guān)貝類主要過敏原TM的研究也越來越深入，但仍存在許多的問題，還需針對不同問題做進(jìn)一步研究。

首先，目前針對貝類致敏原的研究主要集中在甲殼類和致敏原TM上，其他致敏原也有較高致敏性，應(yīng)加強對軟體動物及次要致敏原的研究；其次，消減貝類主要過敏原TM處在研究階段，由于設(shè)備條件的影響以及技術(shù)對食品品質(zhì)的影響，未曾實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，故試驗研究應(yīng)向產(chǎn)業(yè)發(fā)展靠攏；同時，許多研究都是建立在對已分離純化的TM直接消減的基礎(chǔ)上，并沒有考慮整體組織中的其他因素是否對消減TM致敏性有影響，故采用整體原料消減其致敏性的研究很有必要；最后，探究多種加工方法組合消減貝類TM致敏性，最大程度降低或者消除食物致敏性并最大限度保留貝類的風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)，以便未來越來越多的消費者可以將貝類作為一種容易獲得的、更健康的和可持續(xù)的營養(yǎng)來源享用。