張志發(fā),朱夢(mèng)嬌,楊少兵,陶怡芝,王學(xué)仁

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科,武漢 430030

右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一種高選擇性的α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑[1],常用于ICU患者的鎮(zhèn)靜及手術(shù)麻醉的誘導(dǎo)或維持[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定不僅具有抗交感神經(jīng)興奮、鎮(zhèn)痛及穩(wěn)定循環(huán)等特性,其對(duì)正常心肌[3]、腎臟[4]和血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]的炎性反應(yīng)也有顯著的抑制作用。高遷移率族蛋白1(high mobility group box protein-1,HMGB1)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白,參與DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制等生理調(diào)節(jié)過(guò)程。細(xì)胞在受到外界或內(nèi)源性炎性介質(zhì)刺激后,HMGB1可通過(guò)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞主動(dòng)分泌或被動(dòng)釋放的方式轉(zhuǎn)移至胞外,以晚期炎癥因子的形式參與機(jī)體局部或全身炎癥反應(yīng)[6]。Yoo等[7]研究證實(shí)HMGB1可誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)釋放TNF-α和IL-1β等炎性介質(zhì),但對(duì)右美托咪定是否可抑制HMGB1誘導(dǎo)的HUVECs炎性反應(yīng)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究右美托咪定對(duì)LPS刺激HUVECs分泌HMGB1的影響,以及其調(diào)控HMGB1誘導(dǎo)HUVECs炎性反應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

HUVECs購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)研究所。右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司),脂多糖(LPS,Sigma公司),重組人HMGB1蛋白(Abcam公司),DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和青-鏈霉素溶液(Hyclone公司),HMGB1酶聯(lián)免疫試劑盒(Shino-Test公司),IL-1β和TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所),p38 MAPK抑制劑(SB203580,Sigma公司),ERK1/2抑制劑(PD98059,Selleck公司),p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-JNK、JNK抗體(Cell signaling公司),MTT試劑盒、內(nèi)參抗體β-actin(武漢博士德有限公司),ELC化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HUVECs細(xì)胞復(fù)蘇后用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板,待融合度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組(Control組):正常培養(yǎng);LPS組:用含100 ng/L LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液刺激細(xì)胞16 h;LPS+右美托咪定組:100 ng/L LPS刺激細(xì)胞16 h后,不同濃度的右美托咪定(0.01、0.1、1、10 nmol/L)繼續(xù)處理HUVECs 4 h。后期實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Control組):正常培養(yǎng);右美托咪定組:用1 nmol/L右美托咪定的細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞4 h;HMGB1組:用1μg/m L HMGB1的細(xì)胞培養(yǎng)液刺激細(xì)胞16 h;HMGB1+右美托咪定組:用1μg/m L HMGB1孵育細(xì)胞16 h后,1 nmol/L的右美托咪定繼續(xù)處理4 h。

為了檢測(cè)MAPK信號(hào)通路對(duì)HMGB1刺激細(xì)胞炎性因子的影響,SB203580(10μmol/L,p38 MAPK通路抑制劑)或PD98059(20μmol/L,ERK通路抑制劑)分別預(yù)處理細(xì)胞2 h后,維持抑制劑濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 ELISA檢測(cè)

分別以不同濃度的右美托咪定單獨(dú)或聯(lián)合LPS或HMGB1刺 激HUVECs細(xì) 胞,收 集HUVECs培養(yǎng)液,1000 r/min離心5 min后,取上清液,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算HMGB1、TNF-α和IL-1β的含量。

1.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后用細(xì)胞培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液。將無(wú)菌的蓋玻片平鋪于6孔板中,接種細(xì)胞懸液后培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)液,分別加入LPS(100 ng/L,作用4 h)或右美托咪定(1 nmol/L,作用4 h)培養(yǎng)液處理HUVECs細(xì)胞,取出蓋玻片進(jìn)行免疫熒光染色。PBS洗滌、4%多聚甲醛固定60 min、0.5% Triton X-100透膜10 min和封閉后,用HMGB1抗體在4℃孵育過(guò)夜,次日復(fù)溫后滴加二抗室溫孵育30 min,共聚焦熒光顯微鏡下直接檢測(cè)和觀察細(xì)胞內(nèi)HMGB1的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。

1.5 MTT檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,以5×107/L細(xì)胞密度接種于96孔板,每孔100μL,設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。加入不同濃度的(0.01、0.1、1、10 nmol/L)右美托咪定處理,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h,隨后每孔加入90μL新鮮培養(yǎng)液和10μL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸除培養(yǎng)液,加入DMSO溶液150μL并振蕩反應(yīng)10 min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活力。細(xì)胞相對(duì)活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

HUVECs經(jīng)右美托咪定及HMGB1處理后,加入適量的RIPA全裂解液裂解,提取細(xì)胞總蛋白,利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在細(xì)胞總蛋白樣品中加入loading buffer,沸水使其充分變性。然后用SDS-PAGE分離蛋白,經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-JNK、JNK抗體)及二抗孵育雜交后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參照,對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描,比較各蛋白的表達(dá)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,差異顯著者應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對(duì)LPS刺激HUVECs分泌HMGB1的影響

100 ng/m L LPS刺激HUVECs 16 h后,予以不同濃度(0.01、0.1、1、10 nmol/L)的右美托咪定處理4 h。結(jié)果表明,LPS刺激可導(dǎo)致細(xì)胞上清液中HMGB1的濃度增加(P＜0.01,圖1A);1、10 nmol/L右美托咪定可呈劑量依賴性地抑制HUVECs分泌HMGB1(均P＜0.05,圖1A)。為了排除右美托咪定對(duì)HUVECs的毒性作用,我們檢測(cè)了右美托咪定對(duì)HUVECs活力的影響,結(jié)果顯示不同濃度的右美托咪定對(duì)HUVECs的活力無(wú)顯著影響(均P＞0.05,圖1B)。右美托咪定的臨床相關(guān)濃度為1.0～6.0 nmol/L[8],因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)在基于右美托咪定抑制LPS刺激HUVECs分泌HMGB1的前提下,選取臨床濃度范圍內(nèi)的1 nmol/L作為右美托咪定的實(shí)驗(yàn)濃度。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明,HMGB1主 要 位 于HUVECs細(xì) 胞 核,LPS刺 激HUVECs 4 h后可促進(jìn)HMGB1轉(zhuǎn)移至胞質(zhì),而1 nmol/L右美托咪定可抑制HUVECs中HMGB1移位(圖1C)。

圖1 右美托咪定抑制LPS刺激下HUVECs分泌HMGB1Fig.1 Dexmedetomidine inhibited LPS-stimulated HMGB1 release in HUVECs

2.2 右美托咪定對(duì)HMGB1刺激HUVECs分泌炎癥因子的影響

相比于對(duì)照組,外源性1μg/m L HMGB1可顯著促進(jìn)HUVECs分泌TNF-α和IL-1β炎癥因子(均P＜0.01,圖2A、2B);而HUVECs予以右美托咪定繼續(xù)處理4 h后,TNF-α和IL-1β炎癥因子的分泌水平受到顯著抑制(均P＜0.05,圖2A、2B)。

圖2 右美托咪定抑制HMGB1刺激下HUVECs分泌TNF-α、IL-1βFig.2 Dexmedetomidine inhibited HMGB1-stimulated production of inflammatory factors TNF-αand IL-1βin HUVECs

2.3 右美托咪定對(duì)HMGB1刺激HUVECs MAPK信號(hào)的影響

與對(duì)照組相比,1μg/m L外源性HMGB1作用HUVECs 16 h后,可 顯 著 促 進(jìn)ERK1/2、p38 MAPK和JNK的磷酸化;而右美托咪定可抑制ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平(均P＜0.05,圖3),但對(duì)JNK的磷酸化水平無(wú)顯著影響。分別加入ERK1/2抑制劑(PD98059)、p38 MAPK抑制劑(SB203580)預(yù)處理HUVECs 2 h后,ELISA結(jié)果顯示PD98059可抑制TNF-α、IL-1β的表達(dá),右美托咪定與PD98059可協(xié)同抑制TNF-α、IL-1β的合成分泌(均P＜0.05,圖4A、4B);SB203580可抑制IL-1β的表達(dá),但對(duì)TNF-α的表達(dá)無(wú)影響,右美托咪定與SB203580可協(xié)同抑制IL-1β的合成分泌(P＜0.05,圖4A、4B)。

圖3 右美托咪定抑制HMGB1刺激下MAPK信號(hào)通路的磷酸化Fig.3 Dexmedetomidine inhibited phosphorylation of the MAPK signaling pathway stimulated by HMGB1

圖4 右美托咪定通過(guò)p38 MAPK和ERK1/2調(diào)節(jié)HMGB1誘導(dǎo)的HUVECs炎性反應(yīng)Fig.4 Dexmedetomidine regulated the HMGB1-induced inflammatory responses in HUVECs via p38 MAPK and ERK1/2

3 討論

LPS可刺激多種炎癥和免疫細(xì)胞分泌核蛋白HMGB1,而抑制HMGB1可降低動(dòng)物因全身炎性反應(yīng)導(dǎo)致多器官功能障礙的病死率[7],表明HMGB1在炎性反應(yīng)呈“瀑布樣”級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本研究首先通過(guò)LPS刺激HUVECs構(gòu)建細(xì)胞炎性損傷模型,證實(shí)胞核內(nèi)HMGB1可依次通過(guò)胞質(zhì)移位、胞外分泌的方式增加胞外HMGB1的表達(dá)水平,提示HUVECs也是導(dǎo)致HMGB1濃度增加的重要來(lái)源之一[8]。LPS促進(jìn)HUVECs分泌HMGB1的機(jī)制復(fù)雜,不僅與JAK-STAT1調(diào)節(jié)的HMGB1胞質(zhì)移位有關(guān)[9],也與胞質(zhì)內(nèi)高度乙?；腍MGB1被細(xì)胞以主動(dòng)或被動(dòng)形式分泌至胞外有關(guān)[10]。目前雖有研究證實(shí)右美托咪定可通過(guò)JAK-STAT1信號(hào)抑制缺血再灌注損傷[4]或糖氧剝奪[11]后機(jī)體的炎性反應(yīng),但在本實(shí)驗(yàn)中右美托咪定是否也通過(guò)該信號(hào)來(lái)抑制HMGB1胞質(zhì)轉(zhuǎn)位的方式,從而下調(diào)胞外HMGB1的濃度,則需進(jìn)一步的動(dòng)物和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

在缺血缺氧引起心肌細(xì)胞炎性損傷的研究中,Zhang等[12]報(bào)道右美托咪定可通過(guò)抑制HMGB1刺激炎癥因子釋放的方式緩解組織細(xì)胞的炎性損傷,本研究結(jié)果與其一致,證實(shí)右美托咪定預(yù)處理可抑制外源性HMGB1刺激HUVECs產(chǎn)生炎性因子,說(shuō)明右美托咪定是影響HMGB1促進(jìn)組織細(xì)胞分泌炎性因子的因素之一。MAPK信號(hào)通路是生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的蛋白激酶,不依賴第二信使,可將細(xì)胞外的信息直接傳到細(xì)胞核內(nèi)。MAPK主要由3個(gè)亞族組成:細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、p38 MAPK、c-Jun氨 基末端激酶(JNK)。ERK涉及細(xì)胞炎癥、細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附和應(yīng)激等生理過(guò)程中信號(hào)的傳遞[13],而p38 MAPK和JNK則多與細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)[14]。本研究結(jié)果表明,HUVECs在HMGB1的刺激下,ERK1/2、p38 MAPK和JNK 3種蛋白激酶均發(fā)生磷酸化,而右美托咪定則可逆轉(zhuǎn)前兩種蛋白激酶的磷酸化;結(jié)合右美托咪定可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞ERK1/2和p38 MAPK磷酸化的方式抑制炎性因子釋放的研究[15],我們初步推測(cè)右美托咪定對(duì)HMGB1刺激HUVECs分泌TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子的抑制作用與ERK1/2、p38 MAPK的活化有關(guān)。早期研究證實(shí)多種不同來(lái)源的組織細(xì)胞在不同致炎因子刺激下所分泌的炎性因子類型、表達(dá)水平受MAPK信號(hào)通路調(diào)控[16-17],但卻并非所有活化的MAPK亞族均參與了炎性因子的調(diào)控[18-19]。因此,為了進(jìn)一步研究右美托咪定抑制HMGB1刺激HUVECs發(fā)生炎性反應(yīng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),我們檢測(cè)了ERK1/2、p38 MAPK抑制劑聯(lián)合右美托咪定對(duì)HUVECs炎性反應(yīng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)右美托咪定聯(lián)合p38 MAPK抑制劑對(duì)TNF-α的抑制作用并未出現(xiàn)與IL-1β類似的協(xié)同性抑制效果,其主要原因是該抑制劑對(duì)TNF-α的抑制效應(yīng)較弱,推測(cè)可能與p38 MAPK 4個(gè)同源性較高的異構(gòu)體(p38α、p38β、p38γ和p38δ)的分布有關(guān)[20-21],如果HUVECs中p38 MAPK的組成p38γ和p38δ占優(yōu),則可能出現(xiàn)本研究中特異性抑制p38α、p38β亞基的SB203580抑制劑[22]對(duì)TNF-α濃度無(wú)影響的結(jié)果;另外,由于MAPK亞族激酶之間相互作用,抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)其它的信號(hào)通路影響可能也是導(dǎo)致下游炎性因子出現(xiàn)表達(dá)差異的重要因素之一[23]。以上結(jié)果表明ERK1/2、p38 MAPK亞族激酶是右美托咪定抑制HMGB1刺激HUVECs分泌炎性因子TNF-α或IL-1β的重要靶點(diǎn)。

總之,右美托咪定不僅可以抑制LPS引起的HMGB1分泌,也可通過(guò)抑制HMGB1下游MAPK信號(hào)途徑的方式抑制炎癥因子的釋放,從而發(fā)揮其抗炎作用,表明HMGB1是右美托咪定發(fā)揮抗炎作用的重要分子,為下一步通過(guò)動(dòng)物模型驗(yàn)證右美托咪定的抗炎功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。