楊雯雯，查艷芳，毛 菊，胡世蓮，程 民

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma，NHL)是造血系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。根據(jù)GLOBOCAN統(tǒng)計，2020年中國NHL的年齡標準化發(fā)病率為4.3/105，死亡率為2.4/105[1]。NHL發(fā)生骨髓侵犯為臨床分期的Ⅳ期，預(yù)后較差[2]，發(fā)生率按不同亞型為18%～80%[3]。對于骨髓侵犯的NHL病例，臨床多結(jié)合病理骨髓活細胞檢查、流式細胞術(shù)免疫分型檢查和骨髓形態(tài)學檢查等綜合診斷。而部分NHL骨髓局域性侵犯，受取材部位所限，病理檢查可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。流式細胞術(shù)作為一種敏感而快速的細胞及微粒的定量分析技術(shù)，對于NHL的診斷、分型、分期以及殘存病灶的監(jiān)測已成為不可缺少的依據(jù)。本文通過分析同批NHL病例的流式細胞術(shù)免疫分型和病理骨髓活組織檢查骨髓侵犯結(jié)果，比較兩種方法的敏感度和特異度等檢驗效能，以及不同分類的NHL骨髓侵犯發(fā)生率，為NHL診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧分析2019年9月至2020年12月于安徽省腫瘤醫(yī)院腫瘤分子實驗室檢測淋巴瘤免疫分型的初診病例標本資料253例，全部標本均由流式細胞術(shù)作分型檢測，采用自制Excel登記表，收集住院號、床號、姓名、性別、年齡、醫(yī)囑時間、流式免疫分型結(jié)果等信息，另收集同批病例的病理骨髓活檢結(jié)果和臨床診斷。流式和病理實驗均遵醫(yī)囑，不對病人造成額外創(chuàng)傷。共檢測NHL病例253例，其中男146例，女107例；年齡4～90歲，中位年齡57(56.56±15.59)歲，60歲以下139例，60歲及以上114例；B細胞淋巴瘤(B-NHL)189例，T/NK細胞淋巴瘤(T/NK-NHL)64例。

1.2 流式細胞術(shù)實驗和檢測方法 采集病人骨髓標本，肝素抗凝，取20 μL標本與380 μL溶血素震蕩混勻，靜置10 min；取10 μL臺盼藍與10 μL溶血后的標本在計數(shù)儀中計算有核細胞數(shù)(N×103個/微升)；用含有0.1%NaN3和1%～2%BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗液進行前處理；采用兩步法進行抗體標記：第一步標記CD19、CD45、CD20、CD10、Kappa、Lambda、CD4、CD3、CD8、CD7、CD2、CD5初篩，判斷侵犯與否以及B系或T系，第二步根據(jù)系別標記CD19、CD22、CD79b、CD34、CD23、CD38、CD138、CD200、CD56、CD103、CD25、FMC7、ki-67(膜內(nèi))、bcl-2(膜內(nèi))或CD16、CD56、CD25、CD34、TdT(膜內(nèi))、CD3(膜內(nèi))、CD1a、CD57、CD38、TCR αβ、TCR γδ進一步分析亞型；使用Beckman Coulter Navios多色流式細胞儀自動獲取標本，同時進行電壓和補償調(diào)節(jié)，一般獲取10萬個有核細胞；使用Kaluza Analysis軟件對檢測數(shù)據(jù)進行分析，診斷參照WHO 2008年造血和淋巴組織腫瘤分類標準[4]。

1.3 病理骨髓活組織檢查方法 于病人髂后上棘處穿刺并抽取活組織標本，標本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋制片后切片做形態(tài)學觀察和免疫組織化學檢查，診斷參照WHO 2008年造血和淋巴組織腫瘤分類標準[4]。

1.4 結(jié)果判斷 以臨床診斷為金標準，綜合骨髓病理、淋巴結(jié)病理、骨髓流式免疫分型、骨髓形態(tài)學、B超、PET-CT、基因、熒光原位雜交(FISH)等檢查判斷。

1.5 統(tǒng)計方學法 采用χ2檢驗。靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%；正確率=(真陽性+真陰性)/總計；陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性)×100%，陰性預(yù)測值=真陰性/(真陰性+假陰性)×100%。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞術(shù)與病理骨髓活檢NHL骨髓侵犯結(jié)果 流式細胞術(shù)的靈敏度(91.67%)高于病理骨髓活檢(82.29%)，但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.16，P>0.05)，2種方法的特異度均為100.00%(見表1、2)。

表1 流式細胞術(shù)和病理骨髓活檢NHL骨髓侵犯結(jié)果與金標準結(jié)果比較(n)

表2 流式細胞術(shù)和病理骨髓活檢的診斷效能(%)

2.2 流式細胞術(shù)、病理骨髓活檢和金標準的骨髓侵犯率比較 套細胞淋巴瘤(MCL)的骨髓侵犯發(fā)生率較高，分別為84.00%(金標準)、80.00%(流式細胞術(shù))和68.00%(病理骨髓活檢)，彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)的骨髓侵犯發(fā)生率較低，分別為23.75%(金標準)、22.50%(流式細胞術(shù))和22.50%(病理骨髓活檢)；慢性淋巴細胞白血病/小細胞淋巴瘤(CLL/SLL)的病理骨髓活檢與金標準相比，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.28，P<0.01)；MCL、CLL/SLL、濾泡細胞淋巴瘤(FL)、B-NHL未分類的骨髓侵犯率，流式細胞術(shù)較病理骨髓活檢為高，而T/NK-NHL，流式細胞術(shù)檢出的骨髓侵犯率偏低(見圖1、2及表3)。

表3 3種方法檢測不同類型淋巴瘤的骨髓侵犯發(fā)生率[n；百分率(%)]

3 討論

淋巴瘤為一組起源于淋巴結(jié)和結(jié)外淋巴網(wǎng)狀組織的惡性腫瘤，以淋巴結(jié)腫大或局部腫塊為先發(fā)，后可累及骨髓造血系統(tǒng)。淋巴瘤可分為霍奇金淋巴瘤(HL)和NHL兩大類，NHL約占全部淋巴瘤的90%，發(fā)病率高于HL，從惰性到侵襲性，范圍廣泛[5]，發(fā)病較隱蔽，易誤診誤治。WHO對淋巴瘤的界定依賴多種信息，如病理學、形態(tài)學、免疫表型、遺傳學、臨床表現(xiàn)等[6]，結(jié)合這些信息進行分類、分型以及分期，對治療方案的選擇和預(yù)后有重要的指導(dǎo)作用。

NHL骨髓侵犯為臨床分期的Ⅳ期，生存期短，預(yù)后差[7]。病理骨髓活組織檢查之免疫組織化學染色是診斷骨髓侵犯的主要手段之一，該檢測顯示CD20或CD3一種抗原表達為主時提示腫瘤細胞侵犯骨髓[8]。但局域性侵犯時，受髂骨取材所限，可能造成假陰性的結(jié)果[9]。本文中NHL的病理骨髓活檢的假陰性結(jié)果高于流式細胞術(shù)，檢測靈敏度較低。雙側(cè)骨髓活檢可提高檢出率，但多次侵入式取材對病人傷害較大。

流式細胞術(shù)是一種敏感而快速分析細胞及微粒的定量分析技術(shù)，其多參數(shù)相關(guān)分析可以對細胞固有的性質(zhì)以及細胞的標記測定特征同時進行分析，必要時還可同時測定胞漿內(nèi)抗原、核內(nèi)抗原等，可以從一個復(fù)雜的細胞混合體中識別出某一特定的細胞亞群。淋巴瘤免疫分型采用的抗原標志是表達于正常造血細胞不同分化發(fā)育階段的分化抗原，正常造血細胞不同階段的抗原表達是受一系列基因嚴密控制的，在一定的分化階段哪些抗原表達上調(diào)，哪些抗原表達下調(diào)，以及抗原表達量的多少存在著明顯的規(guī)律性，一部分淋巴瘤細胞反映了這種分化模式；但腫瘤細胞經(jīng)常出現(xiàn)異常的抗原表達，這些異常表型可以作為診斷的重要標志，流式細胞術(shù)據(jù)此界定異常細胞的系別(B或T/NK系)以及成熟程度(前體細胞或成熟細胞)，靈敏度高，更易發(fā)現(xiàn)較小的骨髓侵犯。本文中NHL的流式細胞術(shù)檢測結(jié)果的靈敏度、準確率和陰性預(yù)測值均高于病理骨髓活檢，特異度和陽線預(yù)測值與病理骨髓活檢相同，提示兩種檢測方法的誤診率均低，流式細胞術(shù)的漏診率更低。

本文中流式細胞術(shù)、病理骨髓活檢和金標準三種方法檢測不同類型淋巴瘤的骨髓侵犯率提示，B-NHL中，MZL 100%侵犯，可能與樣本量較少有關(guān)。MCL為一種侵襲性淋巴瘤，占NHL的3%～10%，預(yù)后不佳，易復(fù)發(fā)[10]，文獻[8,10-11]顯示其骨髓侵犯發(fā)生率為88%～100%，本研究中MCL的骨髓侵犯發(fā)生率為84.00%(金標準)、80.00%(流式細胞術(shù))和68.00%(病理骨髓活檢)，前二者與文獻接近。DLBCL是一種成人淋巴瘤的常見類型，約占NHL的25.00%[12]，骨髓侵犯發(fā)生率不高，文獻[13]中約為11%～34%，本文中DLBCL的骨髓侵犯發(fā)生率為23.75%(金標準)、22.50%(流式細胞術(shù))和22.50%(病理骨髓活檢)，與文獻一致。CLL/SLL的診斷參考MOREAU等[14]提出的積分系統(tǒng)，病理骨髓活檢與金標準相比，差異具有統(tǒng)計學意義，可能與病例數(shù)及取材次數(shù)較少有關(guān)。T/NK-NHL常見于東亞和拉丁美洲，約占NHL的10%[15]，結(jié)外受累多于骨髓侵犯[16]，文獻中骨髓侵犯發(fā)生率約為35.80%[17]。T/NK-NHL分類較復(fù)雜，分類標準常依賴形態(tài)學或受累部位來源，流式細胞術(shù)出現(xiàn)假陰性可能由于少量淋巴瘤細胞易與反應(yīng)性T細胞混合，不易被檢出[18]，一般需要結(jié)合臨床癥狀和其他檢測作出判斷，較難獨立診斷，且部分特異性抗體如TCR系列價格高昂，國內(nèi)大多實驗室無法負擔。本文中流式細胞術(shù)檢測T/NK-NHL的骨髓侵犯發(fā)生率(29.69%)較病理骨髓活檢(32.81%)和金標準(32.81%)為低，有上述緣故。

綜上所述，NHL骨髓侵犯需參考多種檢測結(jié)果綜合判斷，流式細胞術(shù)較骨髓病理活檢的檢驗效能更高，是一種靈敏、高效的檢測方法，B-NHL較T/NK-NHL更易檢出骨髓侵犯。