錢 臣，徐 揚(yáng)，蔣逸秋

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)均為臨床常見(jiàn)的慢性炎性自身免疫性疾病[1-2]，其具體發(fā)病機(jī)制均尚未闡明。TOLL樣受體4(TOLL-like receptors 4，TLR4)作為參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，是連接非特異性免疫與特異性免疫的橋梁，既往報(bào)道[3-4]顯示其在慢性免疫性炎癥疾病如AS、RA中扮演重要角色。但TLR4在AS、RA病人中的表達(dá)是否存在差異或與AS、RA的臨床與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)是否存在相關(guān)性尚缺乏明確報(bào)道。故本文擬測(cè)定TLR4基因在AS、RA病人中的表達(dá)情況及其與病情活動(dòng)性、有關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系。現(xiàn)作報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月至2017年5月常州市武進(jìn)人民醫(yī)院骨科確診的AS、RA病人各40例，分別為AS組、RA組；另選取30名同期入院體檢的健康志愿者為對(duì)照組。AS組中，男女性別比為3∶2，年齡28～67(44.92±9.55)歲，體質(zhì)量指數(shù)19～28(24.54±2.27)kg/m2，病程4～9(6.40±1.54)年；RA組中，男女性別比為5∶3，年齡35～70(48.59±10.61)歲，體質(zhì)量指數(shù)19～29(24.66±2.40)kg/m2，病程2～9(5.86±1.69)年；對(duì)照組中，男女性別比為3∶2，年齡29～65(45.88±9.75)歲，體質(zhì)量指數(shù)19～28(24.39±3.05)kg/m2。3組性別構(gòu)成比、年齡、體質(zhì)量指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且AS組和RA組對(duì)應(yīng)病程差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本次研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審核通過(guò)。

1.2 對(duì)象納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)性別不限，年齡18～70歲；(2)AS、RA組病人符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(3)所有研究對(duì)象在知情本實(shí)驗(yàn)研究的情況下簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重的心肝肺腎等重要臟器功能損傷及血液系統(tǒng)疾?。?2)既往長(zhǎng)期服用解痙鎮(zhèn)痛類藥物、糖皮質(zhì)激素類藥物；(3)合并頸胸段后凸畸形或其他原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)強(qiáng)直，重疊其他風(fēng)濕性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征及嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)炎等；(4)合并有感染、其他自身免疫性疾病、嚴(yán)重糖尿病、高血壓及嚴(yán)重肝腎疾病；(5)有精神、心理疾病或妊娠、哺乳期婦女。

1.3 病情評(píng)估 AS、RA病情活動(dòng)性分別采用Bath強(qiáng)直性脊柱炎病情活動(dòng)指數(shù)(Bath ankylosing spondylitis disease activity index，BASDAI)評(píng)分[6]、28個(gè)關(guān)節(jié)病情活動(dòng)指數(shù)(disease activity score in 28 joints，DSA28)積分[7-8]評(píng)估，其中BASDAI評(píng)分≤4分、>4分分別為AS穩(wěn)定期、活動(dòng)期；DAS28積分<2.6分、≥2.6分分別為RA穩(wěn)定期、活動(dòng)期。

1.4 外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA檢測(cè) 所有對(duì)象抽取空腹靜脈血3 mL，肝素抗凝，以Ficoll密度梯度離心處理提取單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×109個(gè)/升，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取1 mL培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液，以TRIzol一步法提取總mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取等量逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行TLR4 mRNA熒光定量PCR測(cè)定。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸5 min后，4 ℃ 5 min。引物由大連Takara生物公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列：上游5′-ACT TGG ACC TTT CCA GCA AC-3′，下游5′-TTT AAA TGC ACC TGG TTG GA-3′。取PCR產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠中，120 V電壓電泳30 min。以β-acttin與TLR4的吸光度比值作為TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 所有對(duì)象另抽取空腹靜脈血3 mL，室溫靜置20 min后進(jìn)行離心處理，3 000 r/min離心20 min，離心半徑15 cm，收集上層血清標(biāo)本置于-80 ℃冰箱保存統(tǒng)一待測(cè)。采用乳膠凝集試驗(yàn)法測(cè)定血清類風(fēng)濕因子(RF)水平，Western法測(cè)定血清紅細(xì)胞沉降率(ESR)水平，速率散射比濁法測(cè)定C反應(yīng)性蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定白介素(Interleukin，IL)-17水平；另采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)人白細(xì)胞抗原(HLA)-B27，結(jié)果在正常范圍(0～20%)內(nèi)為陰性，否則為陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t(或t′)檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、方差分析、q檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA比較 外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)水平比較，AS組>RA組>對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

表1 各組外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA比較

2.2 穩(wěn)定期和活動(dòng)期病人TLR4 mRNA的差異 AS組病人平均BASDAI評(píng)分為(5.10±1.85)分，包括穩(wěn)定期21例、活動(dòng)期19例，TLR4 mRNA分別為0.19±0.04、0.26±0.08，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t′=3.44，P<0.01)；RA組病人平均DSA28積分為(4.24±0.99)分，包括穩(wěn)定期14例、活動(dòng)期26例，TLR4 mRNA分別為0.14±0.03、0.20±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.65，P<0.01)。

2.3 各組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 RA組血清ESR、RF、CRP、IL-17水平顯著高于AS組、對(duì)照組(P<0.01)；AS組ESR、CRP、IL-17水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，RF與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AS組HLA-B27陽(yáng)性率顯著高于RA組、對(duì)照組；RA組、對(duì)照組HLA-B27陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 各組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

2.4 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，AS組病人中，外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)與BASDAI評(píng)分及血清ESR、CRP、IL-17水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05～P<0.01)，與RF水平、HLA-B27陽(yáng)性率無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；RA組病人中，外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)與DSA28積分及血清ESR、RF、CRP、IL-17水平呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05～P<0.01)(見(jiàn)表3)。

表3 AS及RA病人病情活動(dòng)性相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA的相關(guān)性分析

3 討論

1994年就已在人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了TLRs，其分為胞膜外區(qū)、胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)三部分，是天然免疫系統(tǒng)中具有特異性的一類Ⅰ型跨膜受體及病原模式識(shí)別受體。既往報(bào)道[9-10]顯示，TLRs可識(shí)別并結(jié)合外源性或內(nèi)源性配體，組成復(fù)合物后活化TLR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子及趨化型的細(xì)胞因子，發(fā)生免疫反應(yīng)，啟動(dòng)抗微生物防御。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLRs相關(guān)蛋白，最初發(fā)現(xiàn)TLR4僅于髓源性細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞)上表達(dá)，隨著研究的深入，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)心臟、呼吸道上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞也均有TLR4的表達(dá)[11]。此后逐漸有報(bào)道論證了TLR4參與了機(jī)體多項(xiàng)病理生理過(guò)程，尤其在急性炎癥反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡中扮演了重要角色。對(duì)于慢性自身免疫性疾病而言，TLR4在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人外周血單個(gè)核細(xì)胞和滑膜組織中表達(dá)顯著升高，且其疾病的活動(dòng)性與TLR4的上調(diào)密切相關(guān)。近年來(lái)，逐漸有學(xué)者[12-13]發(fā)現(xiàn)TLR4基因表達(dá)與AS、RA有關(guān)，TLR4主要表達(dá)于細(xì)胞膜表面，在滑膜細(xì)胞細(xì)胞中也有表達(dá)，可引起持續(xù)的炎性細(xì)胞激活，從而放大滑膜炎癥，加快RA[5]病情進(jìn)展。國(guó)內(nèi)研究[14-16]中證實(shí)LPS/TLR4可激活NF-κB信號(hào)途徑，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，繼而加重RA，因此TLR4主要通過(guò)促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)參與RA的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)AS組、RA組、對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)水平存在明顯差異，AS組、RA組活動(dòng)期病人TLR4 mRNA表達(dá)水平顯著高于穩(wěn)定期病人，證實(shí)了AS、RA病人外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，AS上調(diào)尤其顯著，并可能與疾病活動(dòng)性有關(guān)。分析原因?yàn)椋珹S肌腱附著點(diǎn)炎癥突出、RA滑膜組織炎性增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著，最終均可引起關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的破壞與功能障礙，而且RA的發(fā)生發(fā)展與T細(xì)胞過(guò)度活化、B細(xì)胞過(guò)度刺激引起的大量自身抗體產(chǎn)生有關(guān)。TLR4具有跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，能夠同時(shí)介導(dǎo)觸發(fā)髓樣細(xì)胞分化因子88的依賴性與非依賴性途徑，導(dǎo)致基因編碼的促炎細(xì)胞因子和趨化因子的激活。還有學(xué)者[17-19]認(rèn)為，AS、RA病人外周血單個(gè)核細(xì)胞處于活化狀態(tài)，通過(guò)TLR4可啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng)，合成和釋放炎癥因子，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織和骨組織的破壞。此外，肽聚糖、脂磷壁酸、脂多糖等外源性配體可與TLR4結(jié)合，增強(qiáng)IL-6、IL-17等促炎細(xì)胞因子和趨化因子在AS、RA病人滑膜成纖維細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)，繼而觸發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的炎癥或退化。

本研究結(jié)果表明AS組病人外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)與BASDAI評(píng)分及血清ESR、CRP、IL-17水平正相關(guān)，RA組病人外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)與DSA28積分及血清ESR、RF、CRP、IL-17水平正相關(guān)，提示AS、RA病人外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)與病情活動(dòng)性及炎性指標(biāo)具有相關(guān)性。但TLR4基因影響AS、RA病人病情活動(dòng)性及炎性反應(yīng)的具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入探討，相關(guān)結(jié)論仍需擴(kuò)大樣本量、多中心的研究進(jìn)一步論證。