左文松，劉繼華

（云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南昆明 650000）

鹽酸雷尼替丁膠囊可緩解胃酸過多所致的胃痛、胃灼熱感、反酸，目前主要用于胃炎、胃潰瘍等疾病的治療，因價(jià)格便宜且療效顯著，在國內(nèi)有較大的使用量。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）于2020年4 月1 日下令，要求所有生產(chǎn)商立即從美國市場(chǎng)撤回所有雷尼替丁產(chǎn)品，包括處方藥和非處方藥，原因是有調(diào)查發(fā)現(xiàn)雷尼替丁藥品中含有致癌物N-亞硝基二甲胺（NDMA）。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的致癌物清單，NDMA 屬于2A 類致癌物質(zhì)［1］，在極低濃度水平下即可導(dǎo)致基因突變或致癌［2-5］。因此，控制藥品中NDMA 的含量對(duì)用藥安全有著重要的意義。

根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［6］征求意見，按NDMA TD50 值(導(dǎo)致50%腫瘤發(fā)生率的給藥劑量相當(dāng)于患癌風(fēng)險(xiǎn)可能性水平為1∶2)進(jìn)行計(jì)算，其每日可接受的最大攝入量為96 g，鹽酸雷尼替丁膠囊說明書中表明該制劑雷尼替丁每日最大攝入量為300 mg，所以NDMA 的限度設(shè)定為96 ng/300 mg，即為0.000 032%。雷尼替丁藥品出廠后存放的時(shí)間越長，NDMA 的含量越高，從而導(dǎo)致雷尼替丁藥品中NDMA 含量可能會(huì)超出人體每日攝入NDMA的最高限量，會(huì)給消費(fèi)者造成巨大的風(fēng)險(xiǎn)，因此準(zhǔn)確測(cè)定鹽酸雷尼替丁膠囊中N-亞硝基二甲胺的含量十分必要。

鹽酸雷尼替丁膠囊中NDMA 的檢測(cè)主要有液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用及液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用兩種方法，兩種方法均有較高的靈敏度及準(zhǔn)確度，但液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀價(jià)格昂貴，成本較高。目前藥品領(lǐng)域中有纈沙坦、二甲雙胍、達(dá)卡巴嗪、厄貝沙坦、甲磺酸卡莫司他、阿莫西林、奧美沙坦酯等藥物中NDMA 檢測(cè)的報(bào)道［7-14］，但未見鹽酸雷尼替丁膠囊中NDMA 的檢測(cè)報(bào)道，筆者建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鹽酸雷尼替丁膠囊中N-亞硝基二甲胺，優(yōu)化了質(zhì)譜參數(shù)，提高檢測(cè)靈敏度，為保證該品種的安全用藥及質(zhì)量監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Quantis 型，美國賽默飛科技有限公司。

電子分析天平：BP221S 型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

振蕩水浴槽：THZ-82A 型，金壇市易晨儀器制造有限公司。

離心機(jī)：TDL-5C 型，上海菲恰爾分析儀器有限公司。

渦旋振蕩器：MS 3 型，德國艾卡有限公司。

甲酸：色譜純，美國賽默飛科技有限公司。

甲醇：質(zhì)譜純，美國賽默飛科技有限公司。

NDMA 對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為97.8%，批號(hào)為510166-201902，中國食品藥品檢定研究院。

鹽酸雷尼替丁膠囊：45 批（規(guī)格為0.15 g），來源于不同企業(yè)、不同批號(hào)樣品。

實(shí)驗(yàn)用水為純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ACE EXCEL3 C18-AR（150 mm×4.6 mm，3 μm，英國ACE 公司）。流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為含0.1%甲酸的甲醇溶液；洗脫方式：梯度洗脫，程序見表1；流量：0.5 mL/min，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣體積：5 μL；六通閥切換設(shè)置：0～5 min進(jìn)入質(zhì)譜，其余時(shí)間進(jìn)入廢液。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：大氣壓化學(xué)電離（APCI）源，正離子模式；監(jiān)測(cè)方式：MRM；電離電壓：2.5 kV；離子傳輸管溫度：380 ℃，輔助氣加熱溫度：380 ℃，電暈針電流：4 000 mA，鞘氣流量：10.08 L/min；輔助氣流量：5.58 L/min。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 NDMA 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 樣品處理

取適量鹽酸雷尼替丁膠囊內(nèi)容物，混勻，再精密稱取適量（約相當(dāng)于一粒重量）于三角瓶中，加入甲醇10 mL，渦旋混勻1 min，振搖40 min，離心，取上清液濾過，取續(xù)濾液即得。

1.4 溶液配制

精密稱取NDMA 對(duì)照品52.12 mg，置于50 mL量瓶中，加水稀釋至標(biāo)線，搖勻，再精密量取0.5 mL于500 mL 容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻，即得NDMA 質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱

檢測(cè)主藥中所含的微量基因毒性雜質(zhì)（ppm 級(jí)別）所采用的色譜柱，既需要主藥與待測(cè)物達(dá)到較高的分離度，使主藥能夠通過切換閥流入廢液，防止質(zhì)譜儀污染，也需要較大的載樣量，防止色譜柱過載而使待測(cè)物流失。在此基礎(chǔ)上，分別考察了ACE EXCEL3 C18-AR 柱（150 mm×4.6 mm，3 μm，英國ACE 公司）、Waters BEH 柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm，美國沃特世公司）、Hypersil Gold 柱（100 mm×1 mm，1.9 μm，美國賽默飛公司）、Agilent Poroshell 120 柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國安捷倫公司） 4 種不同品牌型號(hào)的色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NDMA 對(duì)照品溶液在上述4 種色譜柱上均可獲得較好的峰形，注入供試品溶液后，主藥與待測(cè)物在后3 種品牌的色譜柱上保留時(shí)間接近，出現(xiàn)共洗脫，綜合考察，ACE EXCEL3 C18-AR柱對(duì)NDMA 對(duì)照品及供試品溶液均有良好的分離效果，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.1.2 流動(dòng)相

分別考察甲醇-水（含0.1%甲酸） 溶液以及乙腈-水（含0.1%甲酸）溶液兩種流動(dòng)相系統(tǒng)。將1 ng/mL NDMA 對(duì)照品溶液注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，結(jié)果表明，甲醇-水（含0.1%甲酸）溶液系統(tǒng)峰形較尖銳，且與主成分鹽酸雷尼替丁分離度較高，所以選擇甲醇-水（含0.1%甲酸）溶液作為流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別考察ESI 源以及APCI 源對(duì)NDMA 響應(yīng)值的影響。將1 ng/mL NDMA 對(duì)照品溶液注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESI 源信噪比為8，APCI 源信噪比為21。APCI 源能獲得較高的響應(yīng)值，提高靈敏度。結(jié)合NDMA 的結(jié)構(gòu)式，最終采用MRM 正離子模式進(jìn)行測(cè)定。

2.3 提取條件的選擇

結(jié)合NDMA 及主成分鹽酸雷尼替丁的溶解性，分別考察水、甲醇、乙腈3 種溶劑的提取效果。精密稱取樣品3 份，按照1.3 方法，分別以上述3 種溶劑進(jìn)行提取，在1.2 儀器工作條件下依次測(cè)定。結(jié)果表明，所得NDMA 的色譜峰面積分別為6 750、8 215、6 422，甲醇的提取效果較好。由于鹽酸雷尼替丁可降解產(chǎn)生NDMA，且隨著溫度上升，NDMA含量急劇上升［10］，選擇振搖的方式進(jìn)行提取，可避免超聲水溫上升造成NDMA 含量升高。最終選擇用振蕩的方式，以甲醇對(duì)樣品進(jìn)行提取。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取NDMA 質(zhì)量濃度為2 ng/mL 的對(duì)照品溶液，在儀器工作條件下重復(fù)進(jìn)樣6 次，所得色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.4% （小于10%），滿足分析要求；取NDMA 質(zhì)量濃度為1 ng/mL 的對(duì)照品溶液進(jìn)樣，所得主峰信噪比為21.6 （大于10），滿足分析要求。

2.5 線性范圍

分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1、5、10、50 mL 于不同的100 mL 容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻，得NDMA 質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、50、100、500 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。精密量取系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液5 μL 進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸分析，線性方程為y=12 431.840 44x+5 061.354 74；相關(guān)系數(shù)為0.999 9，表明NDMA 的質(zhì)量濃度在1～500 ng/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 檢出限和定量限

精密移取1 ng/mL NDMA 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以水為溶劑進(jìn)行逐級(jí)稀釋，按照3 倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限為0.2 ng/mL，10 倍信照比（S/N）計(jì)算定量限為0.5 ng/mL。

2.7 重復(fù)性

精密稱取樣品6 份，按1.3 方法處理，在1.2 儀器工作條件下測(cè)定，記錄NDMA 峰面積，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3 可知，NDMA 峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性

取樣品溶液，保存于進(jìn)樣瓶中，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，記錄NDMA 峰面積，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4 可知，NDMA 峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.8%，表明樣品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

精密稱取已知NDMA 含量的樣品6 份，分別精密加入NDMA 對(duì)照品溶液，按照1.3 方法進(jìn)行處理，在1.2 儀器工作條件下測(cè)定，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見表5。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表5 可知，加標(biāo)樣品的平均回收率為97.8%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

2.10 樣品測(cè)定

將45 批鹽酸雷尼替丁膠囊按1.3 方法處理，在1.2 儀器工作條件下測(cè)定，結(jié)果表明，45 批次樣品均檢出NDMA。按鹽酸雷尼替丁膠囊中NDMA 的限度要求（0.000 032%），16 批次樣品檢驗(yàn)結(jié)果低于0.000 032%，29 批次樣品檢驗(yàn)結(jié)果高于0.000 032%，低于0.000 633%，平均值為0.000 124%，超出限度一倍（0.000 064%）的樣品有16 批。有研究表明，在正常儲(chǔ)藏條件下，雷尼替丁藥品中的NDMA 含量會(huì)持續(xù)增加，當(dāng)儲(chǔ)存溫度升高（有些消費(fèi)者存放藥物時(shí)可能會(huì)達(dá)到的溫度）時(shí)，雷尼替丁藥品中的NDMA 含量會(huì)更加顯著增加［15］。

3 結(jié)語

采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鹽酸雷尼替丁膠囊中N-亞硝基二甲胺含量。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，可用于鹽酸雷尼替丁膠囊中NDMA 的測(cè)定，為藥品監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持，保障用藥安全。