張苗苗 付倩倩 趙雅玫 周軍利 余小平

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750000；3.甘肅省人民醫(yī)院燒傷科，甘肅 蘭州 730000）

皮膚是人體最大的器官和第一道免疫屏障，具有抵御病原體入侵、調(diào)節(jié)體溫、提供感覺等多種重要功能[1]。創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜且受到高度調(diào)控的過程，關(guān)系到組織的完整性和功能的恢復(fù)[2]。大面積燒傷、壓力性潰瘍等嚴(yán)重和廣泛的皮膚損傷以及糖尿病等疾病損害皮膚的再生能力，會(huì)導(dǎo)致局部細(xì)胞增殖異常、生長因子及干細(xì)胞減少，發(fā)生表皮再生障礙[3]。隨著糖尿病、血管性疾病和肥胖患者的日益增多，慢性創(chuàng)面發(fā)生率增加，但由于慢性創(chuàng)面治療策略有限，治療效果不理想，需要消耗大量醫(yī)療資源，醫(yī)療費(fèi)用昂貴，使慢性創(chuàng)面正成為一個(gè)重大的全球問題[4-5]。皮膚及其附件中存在著不同類型的干細(xì)胞，它們?cè)诰S持皮膚穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)生理?xiàng)l件下的皮膚損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells,ESCs)作為表皮層基底部的細(xì)胞參與了創(chuàng)面修復(fù)的過程。ESCs具有數(shù)量眾多且與胚胎干細(xì)胞相比容易獲得、不存在潛在的倫理學(xué)問題等優(yōu)勢(shì)，因此，采用移植ESCs的方法進(jìn)行創(chuàng)面修復(fù)具有良好的臨床應(yīng)用前景[6-7]。自20世紀(jì)70年代以來，研究人員一直探索利用ESCs進(jìn)行組織再生的方法，部分方法已被證明可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合或替代不可逆丟失的皮膚，比如，ESCs、間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪源性干細(xì)胞結(jié)合絲質(zhì)支架及ESCs與生物材料相結(jié)合的先進(jìn)生物工程皮膚移植可以有效地促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)和再生[8]。ESCs可以作為種子細(xì)胞是其用于各類皮膚退行性病變及皮膚再生研究的基礎(chǔ)和重點(diǎn)，其可在體外培養(yǎng)和所具有的增殖潛力使其成為皮膚生物工程的首選細(xì)胞。本文對(duì)ESCs的特點(diǎn)、在創(chuàng)面愈合過程中的作用機(jī)制以及ESCs在組織修復(fù)中應(yīng)用的研究進(jìn)展綜述如下，探討ESCs在臨床應(yīng)用中的潛力和可行性。

1 ESCs的位置及標(biāo)記

在皮膚表皮中存在多種干細(xì)胞，其中ESCs在表皮形成、表皮組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和皮膚創(chuàng)傷愈合等方面發(fā)揮重要作用。ESCs類型包括毛囊間表皮干細(xì)胞（interfollicular epidermal stem cells, IFESCs）、毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSCs）等。ESCs所處的特定微環(huán)境被稱為干細(xì)胞生態(tài)位，即干細(xì)胞的微環(huán)境，是控制干細(xì)胞增殖、分化和遷移的基礎(chǔ)[9-11]。在皮膚中已發(fā)現(xiàn)了3種不同的ESCs生態(tài)位，包括表皮基底層、毛囊隆突部和皮脂腺的基部[12]。位于不同生態(tài)位的ESCs有不同的生物標(biāo)記物和功能，IFESCs位于濾泡間表皮（interfollicular epidermis，IFE）的基底層，并分化產(chǎn)生基底層細(xì)胞,高水平表達(dá)β1-整合素（CD34）和α6-整合素、富含leu的重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（LRIG）1以及黑色素瘤相關(guān)的硫酸軟骨素蛋白多糖；IFESCs不僅補(bǔ)充基底層，還產(chǎn)生非增殖的、具有轉(zhuǎn)錄活性的棘狀層和顆粒層，最后形成終末分化角質(zhì)層的外層[13]。HFSCs位于毛囊外根鞘的隆突部并具有特異性膨大標(biāo)志物，如CD34、LGR5和轉(zhuǎn)錄因子-3。毛囊的隆突部是角質(zhì)形成細(xì)胞和毛囊細(xì)胞的來源。這些干細(xì)胞能夠再生包括毛發(fā)、皮脂腺和毛囊等許多皮膚結(jié)構(gòu)，特異性細(xì)胞標(biāo)志物有CD34、角蛋白15（cytokeratin，K15）、SRY-box（Sox）9等。

2 ESCs的特性

2.1 ESCs的可塑性 ESCs表現(xiàn)出相當(dāng)大的分化潛能，具有可以在不同環(huán)境下轉(zhuǎn)化或分化為其他類型細(xì)胞的能力，被定義為可塑性[14]。皮膚損傷后IFESCs和HFSCs被招募到濾泡間表皮中時(shí)，它們逐漸失去最初的特性，分化為IFE；長壽命的IFESCs可以被招募到創(chuàng)面并促進(jìn)創(chuàng)面的再上皮化。除IFESCs外，皮膚損傷后HFSCs也表現(xiàn)出可塑性，隆突部和漏斗部的HFSCs向上遷移、增殖并參與表皮修復(fù)過程，遷移的HFSCs逐漸失去其原來的特性，并采用IFE分化程序。然而，HFSCs在IFE中不能長時(shí)間存活，分化的基底層以上表皮細(xì)胞在受傷時(shí)可以去分化為干細(xì)胞。在創(chuàng)面愈合過程中，GATA6陽性細(xì)胞被動(dòng)員，遷移到受傷的IFE，并從分化后的細(xì)胞去分化為干細(xì)胞，并獲得干細(xì)胞特性[14]。在毛囊中也觀察到了去分化現(xiàn)象。皮膚損傷后，隆突部位的HFSCs消失，已分化的漏斗部細(xì)胞或皮脂腺細(xì)胞可以重新填充干細(xì)胞生態(tài)位，并成為功能性HFSCs。干細(xì)胞可以產(chǎn)生分化細(xì)胞，也通過對(duì)稱或不對(duì)稱分裂來繁殖以維持恒定的干細(xì)胞池[15]。

2.2 ESCs的自我更新、動(dòng)態(tài)增殖和遷移 在創(chuàng)面愈合過程中，ESCs通過增強(qiáng)對(duì)稱更新或減少分化細(xì)胞的比例實(shí)現(xiàn)組織更新。在胚胎發(fā)育過程中，大多數(shù)的基底細(xì)胞分裂是對(duì)稱的（由一個(gè)干細(xì)胞產(chǎn)生兩個(gè)相同的子細(xì)胞，表現(xiàn)出分化的表型），并平行于基底膜的軸，維持胚胎表皮的生長和確保上皮保持單層。而在成年后處于內(nèi)穩(wěn)態(tài)的基底細(xì)胞在上皮分層過程中，約70%的基底細(xì)胞的分裂是不對(duì)稱的（一個(gè)子細(xì)胞失去與基膜分泌的整合素和生長因子的接觸而發(fā)生分化，第二個(gè)子細(xì)胞保持與基膜的接觸而保持干細(xì)胞的特征）[16]，從而允許基底層細(xì)胞的發(fā)育和表皮的建立。創(chuàng)面愈合過程中可見角化細(xì)胞增殖增加，然而，細(xì)胞增殖只能在離創(chuàng)面邊緣0.5～1.5 mm的增殖區(qū)檢測(cè)到，而不能在創(chuàng)面邊緣檢測(cè)到；在創(chuàng)面邊緣，位于基底層和基底上層細(xì)胞以細(xì)胞薄片（傷口周圍的上皮組織在靠近傷口的地方形成一個(gè)遷移前沿，遠(yuǎn)端被增殖細(xì)胞的同心圓包圍）的形式遷移[17-18]。細(xì)胞的增殖可以促進(jìn)產(chǎn)生多余的細(xì)胞，隨后遷移到創(chuàng)面中心修復(fù)組織[19]。

3 ESCs的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制

ESCs可對(duì)多個(gè)信號(hào)系統(tǒng)的激活和抑制做出反應(yīng)。ESCs相關(guān)信號(hào)通路中的Wnt和Notch信號(hào)通路對(duì)ESCs“生態(tài)位”發(fā)揮著關(guān)鍵作用[20-21]。當(dāng)皮膚損傷時(shí)，在Wnt和Notch信號(hào)通路的調(diào)控下，干細(xì)胞生態(tài)位在細(xì)胞因子產(chǎn)生、參與細(xì)胞信號(hào)傳遞、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）改變等方面發(fā)生變化[22]。典型的Wnt通路通過抑制糖原合成酶激酶3β發(fā)揮作用，導(dǎo)致未磷酸化的catenin積累，隨后catenin作為DNA結(jié)合蛋白的淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子1/轉(zhuǎn)錄因子家族的核輔因子[23]，促進(jìn)關(guān)鍵微管結(jié)合蛋白的積累，這些蛋白在活性狀態(tài)下穩(wěn)定創(chuàng)面邊緣細(xì)胞的微管，從而促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt和Notch信號(hào)的激活或抑制可通過靶向原癌基因Myc、堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子(c-Myc)和Hes1影響ESCs的增殖、角質(zhì)形成細(xì)胞的分化和遷移以及毛囊再生，最終導(dǎo)致創(chuàng)面愈合增強(qiáng)或延遲；若調(diào)節(jié)功能失控則會(huì)導(dǎo)致皮膚衰老或者腫瘤發(fā)生。另外，可通過吸引和排斥雙重機(jī)制對(duì)軸突生長和細(xì)胞遷移發(fā)揮導(dǎo)向功能的軸突導(dǎo)向因子Nertrin-1蛋白可通過調(diào)節(jié)ESCs功能，減輕紫外線B輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，改善線粒體功能障礙，減輕長期暴露于紫外線造成的皮膚損傷[24-25]。

ESCs的信號(hào)調(diào)節(jié)，既是ESCs發(fā)揮各種潛能的內(nèi)在機(jī)制，也是全面認(rèn)識(shí)ESCs特性及挖掘ESCs轉(zhuǎn)化應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有待于深入探討研究。

4 ESCs在組織修復(fù)中的應(yīng)用

4.1 ESCs在燒傷創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用 由于皮膚及其附件中存在多種干細(xì)胞類型，皮膚顯示出較強(qiáng)的修復(fù)潛力。研究表明，位于毛囊隆突部的干細(xì)胞是皮膚組織更新和創(chuàng)面修復(fù)的新細(xì)胞的重要來源[26]。ESCs可以完成理想的自我更新而形成新的表皮，并保持對(duì)局部信號(hào)的時(shí)空響應(yīng)能力[27]。以ESCs為主體的燒傷創(chuàng)面的自體表皮移植物（cultured epidermal autografts ，CEAs）已經(jīng)取得了良好的效果，并且CEA植入成功與否與ESCs含量的高低有關(guān)[8]。因此，通過富集ESCs可以促進(jìn)皮膚替代物和CEAs的移植。還有研究顯示，在人α-防御素-5誘導(dǎo)的小鼠Ⅲ度燒傷模型中，毛囊膨出部的ESCs的激活加速了創(chuàng)面愈合，重要的是還誘導(dǎo)了毛發(fā)再生[28]，提示這種方法可能成為治療重度燒傷的新方法。同樣，通過熒光激活細(xì)胞分選分離的富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體6（lgr6）陽性ESCs移植并注射到傷口中，可顯著促進(jìn)再上皮化、毛發(fā)生長和血管生成。目前，采用表皮細(xì)胞懸液移植（主要移植ESCs）與刃厚皮網(wǎng)狀移植技術(shù)相結(jié)合，在緩解燒傷患者疼痛、減少供區(qū)損傷、降低住院費(fèi)用及縮短住院時(shí)間方面具有優(yōu)勢(shì)[29-30]；在治療大面積燒傷時(shí)，表皮細(xì)胞懸液還可以同富血小板纖維蛋白、富血小板血漿或富血小板白細(xì)胞凝膠結(jié)合或作為自體刃厚皮移植的輔助治療方案[14,31]，可以取得更加理想的療效。此外，通過使用模擬生態(tài)位力學(xué)特性的載體基質(zhì)，可以提高ESCs的性能，提供正常的生理環(huán)境，優(yōu)化ESCs的再生功能[8]。

4.2 ESCs在慢性創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用 隨著糖尿病、肥胖、血管性疾病和人口老齡化的增加，慢性創(chuàng)面患者也在增加。由于慢性創(chuàng)面的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，許多皮膚替代物和移植物治療已被證明無效。糖尿病創(chuàng)面存在高度蛋白水解的微環(huán)境，基質(zhì)金屬蛋白酶的持續(xù)升高導(dǎo)致ECM降解、炎癥失調(diào)和創(chuàng)面閉合障礙[28]。聶剛等[32]探討了高濃度葡萄糖對(duì)小鼠ESCs增殖的影響，研究結(jié)果表明，高濃度葡萄糖可明顯抑制小鼠ESCs 的增殖。此外，慢性創(chuàng)面還會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)面ESCs數(shù)量的減少，這些ESCs會(huì)因細(xì)胞增殖的增加導(dǎo)致被大量消耗而減少，并且由于微環(huán)境異常而導(dǎo)致表皮無法再生[14]。然而，如果在與ECM具有生物相容性的底物上富集ESCs制備CEAs，再將其移植到慢性創(chuàng)面上，上述負(fù)循環(huán)可能會(huì)被打破，不僅可以解決ESCs減少的問題，還能提供ECM成分來穩(wěn)定創(chuàng)面微環(huán)境。此外，有研究通過離散數(shù)量的基因校正ESCs再生了功能表皮，促進(jìn)了難愈性皮膚潰瘍的修復(fù)[33-35]。

4.3 ESCs在尿道再生中的應(yīng)用 在動(dòng)物模型中采用干細(xì)胞治療膀胱功能障礙、壓力性尿失禁、勃起功能障礙和尿道損傷已經(jīng)取得了令人鼓舞的結(jié)果。皮膚移植已經(jīng)成為尿道再生的一種方法，如口腔黏膜尿道成形術(shù)，形成的尿道組織適應(yīng)有尿液暴露的濕潤環(huán)境，具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，并能通過傷口床的供血迅速實(shí)現(xiàn)血管化；缺點(diǎn)是可供采集的口腔黏膜數(shù)量有限，可能會(huì)出現(xiàn)供區(qū)出血、感染、疼痛、腮腺管損傷、移植物攣縮和麻木等并發(fā)癥。從膀胱培養(yǎng)尿道上皮是另一種方法，但它是一種侵入性的過程，會(huì)造成額外的損傷。干細(xì)胞具有很強(qiáng)的分化能力，可以分化或轉(zhuǎn)分化成所有相關(guān)的細(xì)胞表型，并可以通過旁分泌活動(dòng)調(diào)節(jié)再生過程，因此，干細(xì)胞療法是一種很有前途的自體組織缺乏的修復(fù)方法，并可以減少與移植相關(guān)的并發(fā)癥[36]。HFSCs能夠分化為尿道上皮樣細(xì)胞[37]，缺點(diǎn)是在移植后的幾年里會(huì)在尿道腔內(nèi)生長毛發(fā)[38]。利用干細(xì)胞或組織工程自體管狀尿道的工程化移植物(有或沒有支架)已經(jīng)進(jìn)行了嘗試。Raya-Rivera等[39]報(bào)道，在5名尿道缺陷的男孩中使用管狀尿道，將膀胱組織的干細(xì)胞植入合成管狀網(wǎng)，制成組織工程管狀尿道,再將其移植到5名尿道缺陷男性患兒體內(nèi)，在平均71個(gè)月的隨訪中，成功率達(dá)100%。因此，使用富含ESCs的CEAs被認(rèn)為是修復(fù)功能性尿道的理想方法，它不僅提供不長毛發(fā)的上皮細(xì)胞，而且可以很容易地獲取而不會(huì)產(chǎn)生二次損傷[40]。

4.4 ESCs用于角膜緣干細(xì)胞缺乏的修復(fù) 角膜緣干細(xì)胞或其生態(tài)位的破壞或功能障礙可導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞缺乏（limbal stem cells deficiency, LSCD）。LSCD綜合征的特征是存在角膜上皮穩(wěn)態(tài)失衡，隨后出現(xiàn)潰瘍、結(jié)膜組織持續(xù)炎癥和慢性疼痛,最終會(huì)因角膜混濁導(dǎo)致視力喪失[41-42]。目前的治療方法主要包括角膜緣干細(xì)胞的移植及角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)和移植[43]。角膜上皮與皮膚有許多相似之處，如典型的分層上皮形態(tài)和干細(xì)胞標(biāo)記物p63的表達(dá)。動(dòng)物研究表明，皮膚ESCs可以部分甚至完全恢復(fù)角膜透明度，重建的角膜上皮表達(dá)特異性標(biāo)志物KRT3、KRT12[38]。HFSCs在模擬角膜緣微環(huán)境條件下培養(yǎng)，可以成功地在體外重新編程為角膜上皮細(xì)胞，但相關(guān)臨床研究有限[43]。

4.5 ESCs用于白癜風(fēng)的治療 白癜風(fēng)是一種慢性自身免疫性皮膚脫色疾病，在全世界患病率約為0.5%～2.0%[44]，其特點(diǎn)是黑色素細(xì)胞流失，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)典型的非鱗狀白斑。目前白癜風(fēng)的治療方法有限，主要有308 nm單色準(zhǔn)分子燈或激光靶向光療、富血小板血漿及JAK抑制劑（如ruxolitinib乳膏）等治療[45]。皮膚移植是一種常見的治療方法，但經(jīng)常導(dǎo)致皮膚表面不平整，且改善色素沉著的效果并不理想。CEAs聯(lián)合或不聯(lián)合黑色素細(xì)胞治療白癜風(fēng)已應(yīng)用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CEAs與一定數(shù)量的黑色素細(xì)胞共同移植后，與現(xiàn)有皮膚融合良好，顏色匹配良好，創(chuàng)面愈合而不產(chǎn)生瘢痕。此外，在50%～90%的患者中，應(yīng)用無黑色素細(xì)胞的CEAs，然后暴露在陽光下，可以實(shí)現(xiàn)病變部位的重新著色[46]。毛囊和表皮作為皮膚組織中產(chǎn)生色素的細(xì)胞來源，被認(rèn)為是治療白癜風(fēng)的有利細(xì)胞來源。HFSCs被認(rèn)為在白癜風(fēng)患者病變皮膚的色素沉著中起重要作用[37]。

4.6 ESCs用于大皰性表皮松解癥的治療 大皰性表皮松解癥（epidermolysis bullosa，EB）是一種由層黏連蛋白5或膠原蛋白7缺失等基因突變引起的嚴(yán)重皮膚病，特點(diǎn)是即使是輕微創(chuàng)傷也會(huì)反復(fù)出現(xiàn)皮膚起泡，由此產(chǎn)生的慢性皮膚傷口總是會(huì)發(fā)展成復(fù)發(fā)性感染和瘢痕，這極大地?fù)p害了患者的生活質(zhì)量。EB只有對(duì)癥治療，沒有治愈療法，治療旨在緩解癥狀和誘導(dǎo)更穩(wěn)定的上皮再生，如針對(duì)遺傳缺陷用轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞替代表皮?；蛑委煼椒ò◤幕虍惓；颊咧刑崛SCs，通過基因轉(zhuǎn)移在體外糾正突變，然后將細(xì)胞移植回患者皮膚中[47]。從結(jié)膜炎性EB患者身上提取帶有層黏連蛋白亞單位β3（LAMB3）基因的ESCs可成功完成表皮再生，經(jīng)ESCs治療后患者體內(nèi)可檢測(cè)到功能性層黏連蛋白-5，在移植區(qū)可檢測(cè)到正常的貼壁表皮，這表明利用ESCs進(jìn)行基因治療是一種有前景的遺傳病治療策略。

4.7 ESCs在抗衰老中的應(yīng)用 老年人的皮膚常伴有表皮層和真皮層不同程度的萎縮變薄[48]，伴隨著衰老，干細(xì)胞數(shù)量也不斷減少[49]。ESCs具有多向分化的能力，可通過調(diào)控皮膚的再生、維持其穩(wěn)態(tài)以及影響各種體液因子的活性來調(diào)控衰老的過程。衰老與干細(xì)胞的數(shù)量下降導(dǎo)致組織修復(fù)功能衰退有關(guān)[50]。體內(nèi)研究表明，來自干細(xì)胞的外泌體不僅可以加速創(chuàng)面愈合和血管生成，而且對(duì)皮膚年輕化至關(guān)重要[51]。ESCs可調(diào)控增加成纖維細(xì)胞的Ⅰ型膠原蛋白生成，在皮膚保濕、維持真皮致密度、減少皺紋形成、減輕皮膚松弛下垂等方面發(fā)揮作用。該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究可能是現(xiàn)代皮膚病學(xué)和美容學(xué)的重大突破。

5 展 望

由于ESCs數(shù)量多、容易獲得且在表皮形成和分化中具有多能性，在組織修復(fù)策略的研究中顯示出良好的前景。目前ESCs在實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用方面還存在許多問題，如技術(shù)復(fù)雜、成本高，且多能性或胚胎干細(xì)胞產(chǎn)品的不規(guī)范使用已被證明會(huì)導(dǎo)致新生惡性腫瘤，鞘內(nèi)注射聯(lián)合干細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)神經(jīng)增生病變等，但在未來，對(duì)ESCs的生物學(xué)知識(shí)和應(yīng)用技術(shù)的安全性可能會(huì)提高，使ESCs在創(chuàng)面愈合和組織再生方面的應(yīng)用更加廣泛。