郭亞瑞,鄭賀予，馮秀艷,周偉強(qiáng)

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)班，遼寧 沈陽(yáng) 110034；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽(yáng) 110002)

近年來(lái)，組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)作為低毒、有效的抗腫瘤藥物越來(lái)越受到人們的關(guān)注，西達(dá)苯胺(chidamide)是第三代口服型、針對(duì)組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)1、2、3和10亞型的苯胺類的HDACi[1]。西達(dá)苯胺通過(guò)表觀遺傳修飾影響乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)屬于一類含有200多個(gè)核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄物，可以通過(guò)與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與多種病理生理過(guò)程[3-4]。因此，本研究旨在探討特異LncRNA與靶蛋白互作對(duì)西達(dá)苯胺作用乳腺癌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(ATCC細(xì)胞庫(kù))；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素(Thermo Scientific)；西達(dá)苯胺(Chipscreen Biosciences Ltd)；Muse Count&Viability試劑盒(Merck Millipore)；抗體(Abcam Inc)；siRNA(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞分析儀(Premego)，PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(Life Technology)，多通道化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(以色列DNR)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(添加100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，在含有5%的CO2、37 ℃飽和濕度下培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 MTT法檢測(cè)不同濃度西達(dá)苯胺(0、20、100 μmol·L-1)作用后的細(xì)胞存活率。

1.2.3高通量測(cè)序篩選差異表達(dá)LncRNA分子 將西達(dá)苯胺與MCF-7細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h，根據(jù)試劑盒說(shuō)明提取樣品的總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，PCR擴(kuò)增并純化，然后再對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，最后上機(jī)測(cè)序。之后聯(lián)合生物信息學(xué)軟件分析西達(dá)苯胺作用后差異表達(dá)的LncRNA及互作蛋白。

1.2.4Muse自動(dòng)細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞活力 根據(jù)Muse Count &Viability試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)。

1.2.5LncRNA ENST00000448869.1-siRNA和Nestin-siRNA分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞 根據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明，將LncRNA ENST00000448869.1-siRNA和Nestin-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6全細(xì)胞RNA提取和Real-time PCR 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明提取全細(xì)胞RNA，第一條鏈cDNA合成后，應(yīng)用SYBR Green方法，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，mRNA相對(duì)表達(dá)量按照2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab1 Sequence of primer(5′-3′)

1.2.7Western blot檢測(cè)Nestin表達(dá)變化 西達(dá)苯胺與MCF-7細(xì)胞共同孵育24 h，收集細(xì)胞提取總蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白含量，電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育后，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果

2.1 西達(dá)苯胺對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響低濃度(20 μmol·L-1)和高濃度(100 μmol·L-1)的西達(dá)苯胺作用時(shí)，490 nm吸光度都比對(duì)照組明顯降低(P<0.01)。

2.2 西達(dá)苯胺對(duì)MCF-7細(xì)胞中LncRNA ENST00000448869.1和Nestin表達(dá)的影響高通量測(cè)序聯(lián)合生物信息學(xué)軟件分析，西達(dá)苯胺組中LncRNA分子 ENST00000448869.1比對(duì)照組高表達(dá)，并與Nestin存在蛋白互作關(guān)系。Real-time PCR結(jié)果顯示，在20 μmol·L-1(P<0.05)和100 μmol·L-1(P<0.01)的西達(dá)苯胺組中ENST00000448869.1與Nestin的RNA水平明顯增高。

2.3 LncRNA ENST00000448869.1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MCF-7細(xì)胞的影響為了進(jìn)一步明確特異LncRNA ENST00000448869.1和Nestin之間的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)特異siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，Real-time PCR結(jié)果顯示siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，LncRNA ENST00000448869.1的RNA水平比西達(dá)苯胺組明顯降低(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示，Nestin的蛋白水平也在siRNA轉(zhuǎn)染后降低。Muse細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞活力的結(jié)果表明，LncRNA ENST00000448869.1-siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，與西達(dá)苯胺共同孵育，活細(xì)胞比率為55.9%，與對(duì)照組的63.3%相比明顯降低，與西達(dá)苯胺組70.1%相比也明顯降低。

2.4 Nestin-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MCF-7細(xì)胞的影響為了進(jìn)一步探討Nestin是否反向作用LncRNA ENST00000448869.1，采取Nestin-siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞。結(jié)果顯示，Nestin被siRNA敲降后，其基因和蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而對(duì)LncRNA ENST00000448869.1的基因表達(dá)無(wú)明顯影響。

3 討論

西達(dá)苯胺對(duì)乳腺癌有明顯的抑制作用，有研究表明，西達(dá)苯胺調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中p21waf1/cip1蛋白的表達(dá)，從而阻斷細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡[5]。我們的實(shí)驗(yàn)表明西達(dá)苯胺可以降低MCF-7細(xì)胞活細(xì)胞比率。LncRNA已被確定為乳腺癌發(fā)育的關(guān)鍵組成部分，有研究表明LncRNA的失調(diào)通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐藥性[6]。我們通過(guò)高通量測(cè)序聯(lián)合生物信息學(xué)軟件，分析篩選出LncRNA分子ENST00000448869.1在西達(dá)苯胺作用MCF-7細(xì)胞后出現(xiàn)高表達(dá)，并與Nestin存在蛋白互作。我們的結(jié)果說(shuō)明西達(dá)苯胺作用乳腺癌細(xì)胞后存在LncRNA ENST00000448869.1與Nestin互作，拮抗西達(dá)苯胺的作用，而Nestin不能反向作用LncRNA ENST00000448869.1的表達(dá)。

Nestin是第Ⅵ類中間絲蛋白(intermediate filament，IF)家族的成員，在癌細(xì)胞中的表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和化療抵抗等惡性表型相關(guān)[7]。Nestin是癌癥干細(xì)胞表型相關(guān)的一種蛋白，Nestin的表達(dá)增高更能顯示腫瘤原性，體現(xiàn)腫瘤的惡性程度。LncRNA ENST00000448869.1的高表達(dá)是乳腺癌細(xì)胞對(duì)抗西達(dá)苯胺的一種正常的生理反應(yīng)。西達(dá)苯胺作用乳腺癌細(xì)胞后，由LncRNA ENST00000448869.1誘導(dǎo)的Nestin的表達(dá)增加，相當(dāng)于乳腺癌細(xì)胞的耐藥。在本實(shí)驗(yàn)中，LncRNA ENST00000448869.1的功能被siRNA靜默后，導(dǎo)致Nestin的功能下降，最終導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞腫瘤原性和生長(zhǎng)活力的降低，從而增強(qiáng)了西達(dá)苯胺的作用。此研究為進(jìn)一步探索LncRNA ENST00000448869.1和Nestin在西達(dá)苯胺在乳腺癌中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為更好的研究LncRNA ENST00000448869.1調(diào)控Nestin的表達(dá)在抵抗西達(dá)苯胺的耐藥機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。