劉 坤，殷九一，程 華，李會宣，李 娜，郭 彤，李 依，王俊麗，王軍朋

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院；2.河北經(jīng)貿(mào)大學數(shù)學與統(tǒng)計學院，河北省 石家莊 050061；3.河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050081；4.中央民族大學生命與環(huán)境科學學院，北京 100081；5.河南大學淮河醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心和感染免疫研究所，河南 開封 475000)

新型冠狀病毒肺炎-2019(Corona Virus Disease-2019，COVID-19)是人體感染新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)而引起的一種急性呼吸道傳染病[1]。截至2021年1月21日24時，全國累計報告確診病例88 804例，79個國家確診病例超過10萬例，成為目前影響最大的流行性疾病[2]。大量研究已證實，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)、非結(jié)構(gòu)蛋白-15核糖核酸內(nèi)切酶(nonstructural protein-15 endoribonuclease，NSP15)、刺突蛋白受體結(jié)合域(the receptor-binding domain of spike protein，RBD of S protein)和主蛋白酶(main protease，Mpro/3CLpro)可以作為防止SARS-CoV-2感染的理想的藥物作用靶點[3]。

樹舌靈芝(Ganodermaapplanatum)有調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)，抗病毒抗炎和抗菌等藥理活性[4]。其菌中的部分化合物具有抗病毒、抗纖維化和抗炎等生物活性，如：樹舌靈芝的Applanatumin A具有抗纖維化作用[5]；其中的核酸可以減少雞胚成纖維細胞組織培養(yǎng)中牛痘病毒斑塊的數(shù)量[6]；其多糖具有抗SARS病毒的活性[7]。鑒于COVID-19的主要癥狀(咳嗽、呼吸困難、胸痛等)[8]、病因病機和樹舌靈芝的傳統(tǒng)功效，推測樹舌靈芝在COVID-19的防治中發(fā)揮積極作用。

為了從現(xiàn)代科學角度充分分析樹舌靈芝在COVID-19防治方面的物質(zhì)基礎及其作用機制，本課題組擬通過UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS系統(tǒng)鑒定其中的化學成分，運用網(wǎng)絡藥理學技術研究樹舌靈芝化學成分在防治COVID-19過程中的功效及作用機制，通過分子對接技術進行有效成分與ACE2和3種SARS-CoV-2蛋白(NSP15，RBD of S protein，Mpro/3CLpro)的虛擬對接，預測樹舌靈芝中化學成分抗SARS-CoV-2的活性，為樹舌靈芝防治COVID-19的研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料樹舌靈芝(Ganodermaapplanatum)采自東北阿爾山，經(jīng)河北經(jīng)貿(mào)大學張香美教授鑒定，標本(ZYMZDX121740)保存于中央民族大學生命科學與環(huán)境學院。樹舌靈芝提取物為課題組提前制備。乙腈和甲酸(Thermo Fisher公司)均為色譜純，超凈水自制，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS系統(tǒng)：Thermo fisher U3000超高性能液相色譜儀，美國Thermo Scientific公司；Q Exactive PlusTMOrbitrap質(zhì)譜系統(tǒng)，配有加熱電噴霧電離源，美國Thermo Scientific公司。

2 方法

2.1 分析及鑒定

2.1.1液相條件 UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS液質(zhì)聯(lián)用儀：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(B)-乙腈(A)。梯度洗脫：0～10 min，100% B；10～20 min，100%～70% B；20～25 min，70%～60% B；25～30 min，60%～50% B；30～40 min，50%～30% B；40～45 min，30%～0% B；45～60 min，0% B；60～60.1 min，0%～100% B；體積流量為0.2 mL·min-1；柱溫30 ℃；DAD檢測器，波長范圍為200～400 nm；進樣體積5 μL。

2.1.2質(zhì)譜條件 UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS液質(zhì)聯(lián)用儀：離子源為加熱電噴霧電離源(HESI)，采用正負離子模式檢測；質(zhì)子掃描范圍m/z100～1 500；噴霧電壓為3.2 kV；離子傳輸管溫度為320 ℃，輔氣加熱器溫度為350 ℃；鞘氣體積流量為40 arb，輔助氣體積流量為15 arb；MS分辨率R為70 000，MS/MS分辨率R為17 500。

2.2 網(wǎng)絡藥理學分析

2.2.1藥物成分潛在靶標預測 借助SwissADME(http://www.swissadme.ch/)數(shù)據(jù)平臺對已鑒定的化學成分進行篩選，篩選條件為類藥性(drug-likeness，DL)(5項中至少有3個“yes”)和胃腸道吸收(gastrointestinal absorption，GI)為“high”。再借助Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)平臺，對符合篩選條件的化合物進行靶點預測。利用 UniProt 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)規(guī)范與活性成分相關的靶點蛋白，獲得靶點對應的基因名。

2.2.2疾病靶點篩選 在Genecards(https://www.genecards.org)和Drugbank(https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫中輸入關鍵詞“novel coronavirus pneumonia”，搜索疾病靶點，同時運用Venny平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將樹舌靈芝藥效成分調(diào)控的靶點與疾病的治療靶點取交集，得到樹舌靈芝防治COVID-19的交集靶點。

2.2.3核心靶點及PPI網(wǎng)絡分析 通過String數(shù)據(jù)庫(hops://stringdb.org/)分析樹舌靈芝防治COVID-19的交集靶點，構(gòu)建靶點蛋白間的互做網(wǎng)絡關系，將構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡分析結(jié)果導入Cytoscape 3.8.0，根據(jù)度(degree，DC)、度介中心度(Betweenness Centrality，BC)和接近中心度(Closeness Centrality，CC)3個因素篩選網(wǎng)絡中大于平均數(shù)的節(jié)點，進而確定核心靶點。

2.2.4靶點功能通路富集分析 借助于DAVID數(shù)據(jù)庫(hops://david.ncifcrgov/)對疾病相關的藥物活性成分靶點進行GO與KEGG富集分析，設定閾值P<0.05進行篩選，對相互作用的靶點進行功能富集分析，整理分析數(shù)據(jù)，選取前20個條目，利用R語言繪制柱狀圖與氣泡圖，用Cytoscape 3.8.0對網(wǎng)絡進行可視化。

2.2.5“成分-靶點”的分子對接 從RSCB 數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中下載ACE2(PDB ID：IR42)、NSP15(PDB ID：6W01)、RBD of S protein(PDB ID：6M0J)及Mpro/3CLpro(PDB ID：6WNP)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)[9]，使用Auto Dock Tools1.5.6軟件刪除晶體結(jié)構(gòu)中的水分子，進行加氫處理，并且計算蛋白質(zhì)的電荷，最后保存為pdbqt格式文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫獲取小分子化合物的3D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件。利用PyRx軟件(https://pyrx.sourceforge.io/)進行分子對接。

3 結(jié)果

3.1 樹舌靈芝化學成分分析在上述色譜及質(zhì)譜條件下，應用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS獲取相應色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用Compound discover 3.1.0.305軟件選取mzVault Best Match大于80的物質(zhì)進行分析，根據(jù)色譜提供的準確相對分子量計算化合物的精確分子式，最終鑒定了化合物62個(Tab 1)，包括酚酸、香豆素、脂肪酸、萜和生物堿等多種成分。

Tab 1 Identification analysis of components of Ganoderma applanatum

Tab 2 Basic information of some chemical constituents in Ganoderma applanatum

3.2 網(wǎng)絡藥理學預測結(jié)果

3.2.1活性成分和疾病靶點篩選 通過Swiss ADME數(shù)據(jù)平臺，對已鑒定的62個化學成分進行篩選，依據(jù)DL和GI的篩選條件，共篩選出30個主要活性化合物(Tab 2)。

采用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)平臺對30個活性化合物進行靶點預測，去除重復靶點后，共得到樹舌靈芝主要活性化合物潛在靶標593個。通過Genecards和Drugbank數(shù)據(jù)庫，搜索到455個潛在作用靶點。將藥物有效成分的靶點與疾病的靶點交叉，最終得到97個可能與樹舌靈芝防治COVID-19相關的靶點。

3.2.2核心靶點及PPI網(wǎng)絡分析 為了更好地分析樹舌靈芝防治COVID-19的作用機制，運用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了97個靶點的PPI網(wǎng)絡，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.0，進行網(wǎng)絡分析，包含97個節(jié)點和1 040條邊。根據(jù)3個拓撲參數(shù)對PPI網(wǎng)絡中所有節(jié)點進行分析，選取DC>23、BC>0.009和CC>0.541的32個靶點作為核心靶點，核心靶點相關信息見Tab 3。

Tab 3 Information on 32 core targets

3.2.3GO分析及KEGG通路富集分析 為了進一步分析候選靶點的可能作用，通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析，得到GO條目217個(P<0.05)，包含生物過程(BP)條目158個、細胞組成(CC)條目19個和分子功能(MF)條目40個。排名前15的BP條目見Fig 1。KEGG通路富集分析篩選得到89條信號通路(P<0.05)，排名前20的通路及分類見Fig 2。

3.2.4樹舌靈芝化合物-關鍵靶點-通路構(gòu)建 使用 Cytoscape3.8.0軟件對樹舌靈芝30個核心成分及對應的32個核心靶點，核心靶點對應的20條主要通路進行分析，構(gòu)建樹舌靈芝防治COVID-19對應的核心化合物-核心靶點-通路圖(Fig 3)。

Fig 1 GO biological process analysis of effective targets of compounds from Ganoderma applanatum

Fig 2 KEGG enrichment analysis of effective targets of Ganoderma applanatum

Fig 3 Core compound-core target-pathway diagram

3.2.5分子對接研究 將上述核心化合物及2種臨床治療藥物分別與IR42和6W01、6M0J和6WNP靶標蛋白進行分子對接，從另一層面分析核心化合物防治COVID-19的可行性(Fig 4)。分子對接結(jié)合能越小，說明受體和配體之間的親和力越大。

Fig 4 Heatmap based on binding energy among proteins and phytochemicals

4 討論

本研究利用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS系統(tǒng)，快速鑒定到62個化合物，30個化合物GI和DL較好，其中含7個酚酸和4個香豆素。采用網(wǎng)絡藥理學方法構(gòu)建藥物活性成分-靶點-通路等網(wǎng)絡，探討樹舌靈芝防治COVID-19的藥用成分、潛在靶點和作用機制。在30個化學成分中，咖啡酸、七葉亭和瑞香素等在網(wǎng)絡中具有重要作用。據(jù)報道，咖啡酸具有抗單純皰疹病毒、甲型流感和犬瘟熱病毒等活性。Mani等[10]對有望抑制人類冠狀病毒的化合物進行了綜述，其中包含咖啡酸。七葉亭可抑制HBV轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系(HepG2.2.15)中HBV抗原和HBV DNA的表達，亦可抑制體內(nèi)HBV復制[11]。瑞香素具有一定的抗腸道病毒71的作用[12]。Maurya等[13]發(fā)現(xiàn)多個香豆素類物質(zhì)與SARS CoV-2的甲基轉(zhuǎn)移酶、核糖核酸內(nèi)切酶和主要蛋白酶等受體蛋白可以很好的對接，可能會成為COVID-19感染有效的抑制劑。因此，樹舌靈芝的這些酚酸和香豆素類成分可能會在防治COVID-19中發(fā)揮重要作用。

經(jīng)網(wǎng)絡藥理學預測，IL-6、PTGS2和MAPK1等靶點具有重要地位。大量的數(shù)據(jù)顯示細胞因子風暴是COVID-19患者一個重要的死亡原因。IL-6在細胞因子釋放綜合征中起重要作用，阻斷IL-6信號轉(zhuǎn)導通路有望成為治療重癥COVID-19患者的新方法[14]。MAPK1屬于MAPK家族，MAPK信號通路可通過調(diào)節(jié)炎性反應、促進細胞凋亡和參與血管新生等多種途徑在肺纖維化方面發(fā)揮著重要作用[15]。PTGS2(COX2)是主要的前列腺素合成酶，前列腺素E作用于下丘腦，可引發(fā)發(fā)熱，亦具有血管擴張劑和抑制血小板聚集的作用；而凝血是COVID-19嚴重并發(fā)癥，抑制PTGS2，可能會減少COVID-19相關的并發(fā)癥[16]。因此，樹舌靈芝的核心成分可能通過作用于IL-6、PTGS2和MAPK1等靶點對COVID-19起到防治作用。

通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)前20條通路中，病毒傳染性病占了7條，且PI3K-Akt、FoxO、TNF等多條信號通路與肺癌、肺部損傷以及氣道炎癥等肺部疾病密切相關[17]。其中PI3K-Akt通路最為顯著，該通路參與病毒進入細胞的各個方面和免疫應答的發(fā)展。已有研究表明，SARS-CoV-2的內(nèi)吞作用是通過網(wǎng)格蛋白介導的通路發(fā)生的，抑制PI3K/AKT途徑可以抑制利用網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用的病毒的進入，并且抑制PI3K/AKT信號通路可抑制NF-κB和AP-1，最終降低IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達。因此，可以推測樹舌靈芝可能可以通過抑制PI3K/AKT信號通路，來抑制病毒進入細胞和抑制炎癥，進而起到COVID-19的防治作用。

ACE2是SARS-CoV-2進入細胞的主要受體，一旦病毒與ACE2結(jié)合，它的內(nèi)吞作用與血腦屏障病毒一起發(fā)生[18]。3種SARS-CoV-2蛋白，即NSP15、RBD of S protein和Mpro/3CLpro，是SARS-CoV-2感染宿主細胞或自我復制的關鍵蛋白。故將樹舌靈芝中核心化學成分及西藥與4個靶點進行分子對接比較，結(jié)果顯瑞香素和1,4-二羥基-2-萘甲酸與NSP15和RBD of S protein的結(jié)合能分別為：-8.1 kJ·mol-1、-8.4 kJ·mol-1，均低于臨床藥物洛匹那韋和利巴韋林；小白菊內(nèi)酯和1,4-二羥基-2-萘甲酸與Mpro/3CLpro和ACE2結(jié)合能分別為：-6.6 kJ·mol-1、-7.4 kJ·mol-1，略高于洛匹那韋，但低于利巴韋林。其他核心化合物如七葉亭和咖啡酸等的結(jié)合能與化學藥相比，也有不同程度的降低。通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術結(jié)果表明樹舌靈芝對于治療COVID-19應該有較好的療效。

綜上所述，基于UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS技術，本實驗準確快速地對樹舌靈芝中的化學成分進行了識別，較全面的揭示了樹舌靈芝中的主要活性成分。同時基于網(wǎng)絡分析與分子對接技術，以樹舌靈芝為研究對象，對其主要化學成分、作用靶標及其關鍵藥效成分與ACE2和3種SARS-CoV-2蛋白的結(jié)合能力進行分析，初步闡述了樹舌靈芝防治COVID-19可能的物質(zhì)基礎與作用機制，為樹舌靈芝抗COVID-19的進一步藥效和臨床療效試驗研究奠定基礎。