張亞軍，黃玖紅,2，何劉軍，胡春生，楊東林,2，陳中祝，唐典勇

(1．重慶文理學(xué)院藥學(xué)院、創(chuàng)新靶向藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心、激酶類創(chuàng)新藥物重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 永川 402160；2.西南大學(xué)藥學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 北碚 400715)

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種克隆性骨髓增生的惡性血液系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率較高，以患者體內(nèi)9號(hào)和22號(hào)染色體發(fā)生易位形成BCR-ABL融合基因?yàn)樘卣?，該基因表達(dá)的蛋白是組成型酪氨酸激酶[1]。隨著酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)在臨床上的廣泛應(yīng)用，病人生存時(shí)間和生存質(zhì)量都得到了明顯改善。但是TKI存在病人不耐受、耐藥以及無法根治CML等諸多問題，尤其對(duì)于急變期患者緩解率僅為20%～40%，中位生存期僅有6～9個(gè)月[2]。因此，尋找和研究更有效的靶向CML藥物對(duì)治療CML患者具有重要的臨床意義。

細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡是腫瘤細(xì)胞生長的兩大主要調(diào)控機(jī)制，越來越多研究表明化療藥物通過細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用。在慢性髓系白血病治療研究中發(fā)現(xiàn)，分離自豨薟草中的奇壬醇能夠?qū)⒙运柘蛋籽〖?xì)胞K562細(xì)胞周期阻滯于S期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗癌作用[3]；Martnez-Castillo等[4]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠?qū)562細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，誘導(dǎo)caspase-9和caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；Hassanzadeh等[5]發(fā)現(xiàn)槲皮苷通過與熱激蛋白70和90結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，抑制K562細(xì)胞增殖。

有研究報(bào)道，中藥材衛(wèi)矛科雷公藤中的主要活性成分雷公藤甲素和南蛇藤醇具有抗腫瘤作用，能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期阻滯[6-7]。與雷公藤甲素和南蛇藤醇相比，分離自雷公藤的三萜系化合物單體—去甲澤拉木醛(demethylzeylasteral，ZST93)對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小，并且能夠更好地抑制黑色素瘤、惡性膠質(zhì)瘤和乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管形成等[8-11]。此外，ZST93能夠通過誘導(dǎo)自噬性死亡抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，并且增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性[12]。然而，ZST93是否可以作為一個(gè)廣譜性抑制劑在CML中發(fā)揮抗癌作用，至今還未見報(bào)道。

基于此，本研究以人CML細(xì)胞K562為研究模型，檢測了ZST93對(duì)K562細(xì)胞的生長抑制作用，并進(jìn)一步分析ZST93對(duì)K562細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和自噬的影響，旨在探究ZST93在CML細(xì)胞中的活性及可能的抑癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系人慢性髓系白血病細(xì)胞K562購自南京科佰生物科技有限公司(中國)。

1.2 藥物與試劑Demethylzeylasteral (ZST93)、Z-VAD-FMK (上海陶素生化科技有限公司);RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶和青鏈霉素(美國Gibco公司);胎牛血清(fetal bovine serum,南美Natocor公司);細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)、細(xì)胞凋亡試劑盒(Annexin V-fluorescein isothiocyanate isomer/propidiumiodide，AnnexinV-FITC/PI)和結(jié)晶紫(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);碘化丙啶(propidium iodide，美國Sigma-Aldrich公司)。抗體β-Actin (CST-3700S)、CDK4 (CST-12790S)、CDK6 (CST-13331S)、Cyclin D (CST-55506S)、LC3B (CST-43566S)、p62 (CST-88588S)、PARP (poly ADP-ribose polymerase,CST-9532T)、cleaved PARP (CST-5625T)、caspase-8 (cysteinyl aspartate specific proteinase-8,CST-9746S)、cleaved caspase-8 (CST-8592S)、caspase-9 (cysteinyl aspartate specific proteinase-9,CST-9508T)、cleaved caspase-9 (CST-7237T)、caspase-3 (CST-9668T)和cleaved caspase-3 (CST-9661S)(美國Cell Signaling Technology 公司);熒光二抗(美國LI-COR Biosciences 公司)。

1.3 主要儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和臺(tái)式低速離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)；酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；BD AccuriTMC6流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)；SDS-PAGE電泳儀和轉(zhuǎn)模儀(美國BIO-RAD公司)；奧德賽雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國Li-cor公司)；高內(nèi)涵分析系統(tǒng) (美國PerkinElmer公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)與試劑配制 人慢性髓系白血病細(xì)胞K562培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。DMSO溶解ZST93和Z-VAD-FMK配制母液，給藥時(shí)用RPMI 1640稀釋成不同的濃度。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率取處于對(duì)數(shù)期的K562 細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞密度達(dá)到40%時(shí)加入不同濃度的ZST93，分別培養(yǎng)24、48和72 h。每孔中加入10 μL CCK-8 溶液,于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h,酶標(biāo)儀測試各孔450 nm處的吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞存活率;細(xì)胞存活率/%=(A用藥組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布待K562細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)濃度的ZST93處理后，通過胰酶消化、離心后收集細(xì)胞，PBS緩沖液重懸洗滌后加入預(yù)冷的70%乙醇固定24 h。次日取出，離心(1 000 r·min-1，5 min，4 ℃ )，棄上清后用PBS緩沖液再次洗滌2次，然后加入已配制好的細(xì)胞周期檢測試劑200 μL(PBS緩沖液 194 μL，10 mg·L-1RNase 5 μL，5 g·L-1PI 1 μL)，37 ℃避光染色30 min后，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡待K562細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)濃度的小分子化合物(ZST93、Z-VAD-FMK)處理后，通過胰酶消化,室溫下800 r·min-1離心5 min,棄上清,PBS緩沖液重懸洗滌,加入205 μL 細(xì)胞凋亡檢測試劑(Annexin V-FITC結(jié)合液 195 μL，AnnexinV-FITC 5 μL，PI 10 μL)，避光孵育20 min,使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)待K562細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)濃度的小分子化合物(ZST93、Z-VAD-FMK)處理后，收集細(xì)胞，采用預(yù)加PMSF和RIPA裂解液于冰上裂解0.5 h提取細(xì)胞總蛋白。選擇BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組上樣量為25 μg電泳、轉(zhuǎn)膜，5% BSA-TBST封閉2 h，最后進(jìn)行相對(duì)應(yīng)一抗于4 ℃孵育過夜。待TBST洗滌5 min，共3次后，蛋白膜加入IRDye 800CW goat anti-mouse IgG (H+L)或者 IRDye 680LT donkey anti-rabbit IgG (H+L)熒光二抗進(jìn)行室溫孵育1 h，再次進(jìn)行TBST洗滌5 min共3次后，蛋白膜放入雙色紅外熒光成像系統(tǒng)后進(jìn)行曝光，得到蛋白免疫印跡條帶。同時(shí)，β-tubulin蛋白條帶作為參照。

2 結(jié)果

2.1 ZST93對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響ZST93是一種分離自雷公藤的三萜系化合物單體(Fig 1A)，具有抗多種腫瘤細(xì)胞活性。為了研究ZST93在人慢性髓系白血病細(xì)胞中的作用，本研究首先對(duì)其在抑制K562細(xì)胞中的活性進(jìn)行了分析，F(xiàn)ig 1B結(jié)果顯示，ZST93處理24 h后的細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)為2.59 μmol·L-1。隨后，利用0.5、1、2、4和8 μmol·L-1ZST93分別處理K562細(xì)胞24、48和72 h，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長，其相應(yīng)的增殖抑制率明顯增強(qiáng)，呈濃度和時(shí)間梯度依賴性(Fig 1C)。進(jìn)一步在顯微鏡下對(duì)不同濃度ZST93處理后的K562細(xì)胞進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，隨著ZST93濃度升高，顯微鏡視野中的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(Fig 1D)，表明ZST93能夠抑制人慢性髓系白血病細(xì)胞K562的增殖。

2.2 ZST93阻滯K562細(xì)胞周期于G1期Fig 2A流式結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度的ZST93(1、2和4 μmol·L-1)處理K562 細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例減少，G1期細(xì)胞比例明顯增加。通過Western blot進(jìn)一步分析G1期相關(guān)蛋白表達(dá)情況，F(xiàn)ig 2B結(jié)果發(fā)現(xiàn)，致癌蛋白c-MYC、細(xì)胞周期蛋白Cyclin D、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4和CDK6隨ZST93濃度的增加而被顯著下調(diào)，表明ZST93能夠?qū)562細(xì)胞周期阻滯于G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

2.3 ZST93能夠激活K562細(xì)胞自噬人類多種腫瘤中存在自噬異常,自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段均扮演著重要角色。為了研究ZST93對(duì)K562細(xì)胞中自噬的調(diào)控作用，本研究通過熒光顯微鏡下觀察GFP-LC3融合蛋白分布和LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ的比例來示蹤自噬形成。如Fig 3A所示，與對(duì)照相比，ZST93處理后多個(gè)明亮的融合蛋白GFP-LC3綠色熒光斑點(diǎn)分布在K562細(xì)胞質(zhì)中。同樣，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著ZST93藥物濃度增加，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ的比例升高，說明ZST93導(dǎo)致自噬體在K562細(xì)胞中大量積累。此外，自噬流標(biāo)志蛋白p62隨ZST93藥物濃度增加而減少，標(biāo)志著ZST93促進(jìn)自噬流(Fig 3B)。已有研究表明MAPK/ERK信號(hào)通路在自噬激活中發(fā)揮著重要作用[13]。Fig 3B結(jié)果顯示，隨著ZST93藥物處理濃度升高，p-ERK的水平增加，表明ZST93可能通過激活ERK而調(diào)控細(xì)胞自噬。

2.4 ZST93誘發(fā)K562細(xì)胞外部凋亡信號(hào)通路近來研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)ZST93能夠通過誘導(dǎo)自噬而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞死亡[12]。為了研究ZST93激活自噬后在K562細(xì)胞凋亡中的作用，本研究通過Annexin V-FITC/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。流式細(xì)胞結(jié)果顯示(Fig 4A)，與對(duì)照組相比，不同濃度的ZST93(1、2和4 μmol·L-1)處理K562細(xì)胞48 h后，可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且其總凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)呈劑量依賴性增加，隨著給藥濃度增加，細(xì)胞凋亡率從6.15%增加到了44.63%(P<0.001)，說明ZST93能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡(Fig 4B)。為了進(jìn)一步分析ZST93誘導(dǎo)K562發(fā)生細(xì)胞凋亡的方式，利用Western blot檢測外部凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白，F(xiàn)ig 4C結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZST93誘發(fā)caspase-8、caspase-3、caspase-9和PARP發(fā)生剪切，并具有濃度依賴性，表明ZST93激活外部凋亡信號(hào)通路。

Fig 1 The anti-proliferative effect of ZST93 on K562 cell n=3)A:The chemical structure of ZST93;B:IC50 value of ZST93 in K562 cells was calculated;C:The inhibitory rate of ZST93 on K562 cells.K562 cells were exposed to indicated concentrations of ZST93 for 24,48 and 72 h.CCK8 was performed to measure cell viability and growth;D:Cell morphology of K562 cells was captured with microscope after treatment with vehicle (0.05% DMSO)or the indicated concentrations of ZST93 for 48 h.magnification:×100.The histogram showed the quantification of cell proliferation rate.**P<0.01 vs vehicle.

Fig 2 ZST93 induced cell cycle at G1-phase to exhibit anticancer effectA:The cell cycle of K562 cells was measured by flow cytometry in the presence of vehicle or ZST93;B:Percentages of cell in different periods;C:Effect of ZST93 on the expression levels of G1 related proteins in K562 cells.

Fig 3 ZST93 initiated autophagy in human K562 cells n=3)A：The punctate staining pattern of LC3 was detected using high content analysis system-operetta CLSTM in K562 cells after treatment with increasing concentrations of ZST93 for 48 h.Scale bar:10 μm；B：The protein expression levels involved in autophagy were detected Western blot.**P<0.01 vs vehicle.

Fig 4 ZST93 induced caspase-8-dependent extrinsic apoptotic cell death in human K562 n=3)A：Apoptotic cell death in K562 cells was measured by flow cytometry after treatment with or without ZST93 for 48 h；B：The histogram showed the corresponding quantification of early and late apoptosis rate；C：The expression of caspase pathway related proteins in K562 cells was examined by Western blot after exposure to ZST93 for 48 h.β-actin was loaded as a control.**P<0.01 vs vehicle.

2.5 caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK降低ZST93誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡Z-DEVD-FMK是一個(gè)選擇性的caspase-3抑制劑，能夠有效抑制caspase-3的活性。為了明確Z-DEVD-FMK是否能夠減弱ZST93誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡，本研究利用Z-DEVD-FMK和ZST93同時(shí)處理K562后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測K562細(xì)胞凋亡情況，如Fig 5A，B所示，與4 μmol·L-1ZST93單獨(dú)處理K562細(xì)胞相比，50 μmol·L-1Z-DEVD-FMK和 4 μmol·L-1ZST93同時(shí)處理能夠明顯降低K562細(xì)胞凋亡率。Western blot進(jìn)一步分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)(Fig 5C)，Z-DEVD-FMK能夠明顯減弱ZST93誘導(dǎo)的caspase-9、caspase-3和PARP剪切，表明ZST93誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡依賴于caspase-3。

Fig 5 Z-DEVD-FMK,the inhibitor of caspase-3,decreased apoptosis in K562 induced by n=3)A：Apoptotic cell death in K562 cells was measured by flow cytometry after treatment with or without ZST93,Z-VAD-FMK (50 μmol·L-1),ZST93 and Z-VAD-FMK (50 μmol·L-1)for 48 h；B：The histogram indicated the corresponding quantification of early and late apoptotic rate；C：The expression of caspase pathway related proteins in K562 cells was evaluated by Western blot after exposure to ZST93,Z-VAD-FMK (50 μmol·L-1),ZST93 and Z-VAD-FMK (50 μmol·L-1)for 48 h.**P<0.01 vs vehicle.

3 討論

慢性髓系白血病患者主要經(jīng)歷3個(gè)不同階段，即慢性期、加速期和急變期，其中急變期患者癥狀惡化迅速，對(duì)健康造成嚴(yán)重威脅。目前，臨床上常用的酪氨酸激酶抑制劑，如伊馬替尼，大大提高了CML患者的生存時(shí)間和生存質(zhì)量。但是由于耐藥、病人不耐受以及對(duì)部分患者欠佳等問題，尋找和研究能夠抑制CML細(xì)胞生長、增殖、耐藥和復(fù)發(fā)的治療藥物迫在眉睫[14]。已有研究報(bào)道，ZST93對(duì)包括黑色素瘤[9]、惡性膠質(zhì)瘤[10]、乳腺癌[11]和胰腺癌[12]在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞具有抑癌活性。然而，ZST93抑制CML的活性還有待進(jìn)一步分析。本研究顯示ZST93能夠抑制慢性髓系白血病細(xì)胞K562生長和增殖，并且呈濃度和時(shí)間依賴性。

自噬是一個(gè)進(jìn)化上保守的動(dòng)態(tài)過程，該過程中一些折疊錯(cuò)誤的蛋白或受損的細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，與溶酶體融合形成自噬-溶酶體，最終使包裹物質(zhì)被降解。自噬能夠增加或降低腫瘤細(xì)胞的生長，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有“雙刃劍”的角色[15]。MAPK/ERK信號(hào)通路的激活調(diào)控了諸如細(xì)胞增殖、遷移和分化等重要過程，研究發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK在多種腫瘤細(xì)胞被激活，MAPK/ERK激活不僅與細(xì)胞生存有關(guān)，而且與細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老有關(guān)[16]。本研究中ZST93處理K562細(xì)胞后,使得GFP-LC3積累在細(xì)胞質(zhì)中、LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ的比例明顯升高以及自噬流標(biāo)志蛋白P62隨ZST93藥物濃度增加而減少，表明ZST93能夠激活細(xì)胞自噬。有研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞中MAPK/ERK激活后通過促進(jìn)自噬流穩(wěn)定蛋白FOXO1 (Fork head Box O1)的降解，從而抑制自噬過程[17]。但是，ZST93激活MPAK/ERK后，促進(jìn)自噬發(fā)生是否通過降解FOXO1 來實(shí)現(xiàn)還需要今后深入探索。

在CML的發(fā)病機(jī)制中，細(xì)胞凋亡起著重要作用，細(xì)胞凋亡和增殖之間的失衡會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤細(xì)胞凋亡包括依賴凋亡受體的外部凋亡和線粒體途徑的信號(hào)通路，caspase家族蛋白在這兩條凋亡途徑中都扮演著重要角色。外部凋亡信號(hào)通路中激活的caspase-8和內(nèi)部凋亡信號(hào)通路中激活的caspase-9都激活細(xì)胞凋亡最終執(zhí)行者—caspase-3，激活的caspase-3進(jìn)而剪切下游底物PARP，最后導(dǎo)致凋亡發(fā)生[18]。本研究中,ZST93激活K562細(xì)胞自噬，進(jìn)一步誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生早期和晚期細(xì)胞凋亡，并促使caspase家族中caspase-3、caspase-8、caspase-9以及PARP呈濃度依賴性發(fā)生剪切，這提示ZST93可能通過調(diào)控自噬誘導(dǎo)外部凋亡信號(hào)通路，激活凋亡相關(guān)因子的表達(dá),促使K562細(xì)胞凋亡。此外，近來研究表明，細(xì)胞周期分布異常是誘發(fā)腫瘤發(fā)生發(fā)展的另一個(gè)特征，藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，通常與細(xì)胞周期阻滯共同發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,ZST93可誘導(dǎo)K562細(xì)胞周期阻滯于G1期，阻止了其細(xì)胞周期進(jìn)入S期。

本研究結(jié)果表明，ZST93能夠抑制K562細(xì)胞生長和增殖，是K562細(xì)胞抑制劑，能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和外部凋亡信號(hào)通路，并探討了其可能的作用機(jī)制：ZST93激活了MPAK/ERK以及自噬性死亡通路，并最終激活了caspase-8、caspase-9、caspase-3和PARP凋亡信號(hào)通路。綜上所述，本研究為ZST93藥物用于抗CML腫瘤藥物研發(fā)提供了研究基礎(chǔ)，但其體內(nèi)活性還需進(jìn)一步開展動(dòng)物研究，將為CML臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。