崔藝璇，周 翔，劉 寬，馬學(xué)玉，肖焱波，祁艷艷，李干鵬

(云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

心肌炎(myocarditis)是由于心肌損傷后，免疫炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)心肌造成的炎癥疾病。心肌炎中約30%可能會(huì)進(jìn)展為擴(kuò)張性心肌病，占所有非缺血性糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)成人患者中的9%～16%[1]，其中12%～17%的患者會(huì)由心肌炎導(dǎo)致心力衰竭[2]。由心肌細(xì)胞和免疫細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子形成的抗炎機(jī)制對(duì)維持心肌功能和研究相關(guān)信號(hào)通路具有重要的作用。DCM已被證實(shí)為糖尿病獨(dú)立的并發(fā)癥，是無(wú)法用高血壓性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及其他心臟病變來(lái)解釋的心肌疾病，亦是引起糖尿病患者心力衰竭和死亡的高風(fēng)險(xiǎn)因素之一。臨床上主要表現(xiàn)為左心室功能障礙、心肌間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞肥大，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)[3]。DCM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及高糖所致的心肌細(xì)胞毒性反應(yīng)和微血管病變、心肌細(xì)胞線粒體損傷、心肌脂代謝異常、心肌炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡、腎素血管緊張素系統(tǒng)活化以及交感神經(jīng)與鈣輸送異常等多個(gè)方面[4]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)降糖藥物治療后雖然可降低糖尿病病人心衰并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，卻無(wú)法顯著地降低DCM的預(yù)后，必須同時(shí)給以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、利尿劑及β-受體阻滯劑等以緩解心功能不全所引發(fā)的癥狀[5]。持續(xù)高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的促炎因子如核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)及白介素-6 (interleukin-6，IL-6)等的產(chǎn)生。且在炎癥反應(yīng)時(shí)，心肌細(xì)胞周圍基質(zhì)發(fā)生重構(gòu)[6]，心肌收縮力顯著性下降，同時(shí)心肌細(xì)胞凋亡大量發(fā)生，繼而發(fā)生代償性的增生以及心肌肥大。通過(guò)對(duì)心肌炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的研究，可在一定程度上促進(jìn)既有降糖作用又能改善心功能不全的DCM新型有效治療藥物的發(fā)掘。

經(jīng)典瞬時(shí)受體電位(canonical transient receptor potential，TRP)通道是一組鈣通透性通道，含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(S1-S6)，包含C1-C7等7個(gè)成員，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[7]。雖然TRPC5在DCM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用至今還少有報(bào)道，但在心衰病人的心臟組織中均發(fā)現(xiàn)有TRPC5在mRNA及蛋白水平的表達(dá)增高[8]。本課題組前期研究顯示，高糖喂養(yǎng)條件下，TRPC5-/-小鼠空腹胰島素水平顯著性高于C57BL/6J小鼠[9]，且在TRPC5基因被抑制后可顯著降低2型糖尿病小鼠血糖水平。鑒于炎癥反應(yīng)在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的重要作用[10]，本文旨在系統(tǒng)闡述TRPC5對(duì)DCM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用，以期為探尋DCM防治的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J種鼠購(gòu)于湖南楚商動(dòng)物養(yǎng)殖中心許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004。TRPC5-/-小鼠由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所提供種鼠，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-000，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)繁殖和飼養(yǎng)，環(huán)境溫度25 ℃，相對(duì)濕度0.40～0.60，光照/黑暗各12 h循環(huán)。

1.2 藥物與試劑EDTA-胰蛋白酶消化液(批號(hào)：SH30042.01)、石蠟(批號(hào)：H1053)、RIPA Lysis Buffer(批號(hào)：CW2333S)、二甲基亞砜(批號(hào)：D8370-100)、β-actin鼠單克隆抗體以及山羊抗小鼠IgG(批號(hào)：SC-133118)、ECL化學(xué)發(fā)光顯色劑(批號(hào)：CW0049M)、多聚甲醛(批號(hào)：P1110)、High Glucose、Low Glucose培養(yǎng)基(批號(hào)：10-040-CV)、胎牛血清(批號(hào)：FSP500)均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；肌酸激酶試劑盒(批號(hào)：H032-1-1)、心肌肌鈣蛋白I(cTn-I)測(cè)試盒(批號(hào)：H149-2)、肌紅蛋白(Mb)測(cè)試盒(批號(hào)：H150)、肌酸激酶同工酶試劑盒(批號(hào)：H197)均購(gòu)自南京建成有限公司生物工程研究所。IL-2小鼠單克隆抗體(F-5)(批號(hào)：SC-133118)、IL-6小鼠單克隆抗體(10E5)(批號(hào)：SC-57315)、IL-1β小鼠單克隆抗體(B122)(批號(hào)：SC-12742)均購(gòu)自艾美捷科技有限公司。

1.3 儀器熒光顯微鏡(DMI3000B，Leica)、微量加樣器(Eppendorf)、蛋白印跡體系(Bio-RAD)、恒溫金屬浴HB系列(Wealtee)、化學(xué)發(fā)光成像儀(ChemiDOCXS+，Bio-RAD)、PCR儀(BIOER)、高壓蒸汽滅菌鍋(LP-CPS500)、-80 ℃冰箱(Thermo)、恒溫水浴鍋(成都泰盟科技有限公司)

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及造模實(shí)驗(yàn)采用5周齡雄性C57BL/6J小鼠10只，體質(zhì)量(18～22)g；5周齡雄性TRPC5-/-小鼠10只，體質(zhì)量(18～22)g。隨機(jī)分為對(duì)照組和高糖組(n=5)，對(duì)照組正常飲水進(jìn)食，高糖組給予質(zhì)量濃度為100 g·L-1的糖水和高糖飼料8周。8周后，高糖組連續(xù)腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ)1周，建立2型糖尿病(T2DM)模型。血糖檢測(cè)結(jié)果高于16.7 mmol·L-1，且停止高糖飼養(yǎng)之后，監(jiān)測(cè)血糖保持在高水平(>16.7 mmol·L-1)不降低則認(rèn)為造模成功。

1.5 生物信息學(xué)分析運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)TRPC5基因進(jìn)行分析，在DAVID網(wǎng)站通過(guò)蛋白互作構(gòu)建找到核心基因，運(yùn)用omicshare對(duì)其進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路富集，將生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能和信號(hào)通路進(jìn)行注釋，對(duì)關(guān)聯(lián)基因構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖(protein-protein interaction，PPI)。

1.6 生化指標(biāo)檢測(cè)取小鼠心臟組織，通過(guò)病理切片進(jìn)行HE以及Masson染色，觀察組織變化，并記錄拍照；提取心臟組織RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，運(yùn)用QPCR檢測(cè)小鼠心肌中IL-6、INF-α、IL-1β、IL-10、IL-18以及TRPC5的表達(dá)情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；取小鼠血清，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白和肌鈣蛋白的含量；并通過(guò)Western bolt檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.7 小鼠原代細(xì)胞指標(biāo)檢測(cè)原代培養(yǎng)TRPC5-/-和C57BL/6J乳鼠的心肌細(xì)胞，使用免疫熒光法進(jìn)行鑒定。巨噬細(xì)胞來(lái)源于C57BL/6J小鼠，通過(guò)高糖培養(yǎng)模擬糖尿病體內(nèi)環(huán)境，與高糖環(huán)境培養(yǎng)的心肌細(xì)胞交換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用RT-PCR檢測(cè)原代小鼠心肌細(xì)胞以及小鼠巨噬細(xì)胞中各種炎癥因子及TRPC5表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)

2.1.1PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目標(biāo)基因TRPC5進(jìn)行搜索，通過(guò)STRING網(wǎng)站對(duì)TRPC5基因相關(guān)聯(lián)的基因所編碼的蛋白進(jìn)行互作分析構(gòu)建PPI，將從STRING中得到的蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)互作。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)在基因本體(gene ontology，GO)中進(jìn)行功能富集，并注釋其參與的生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，通過(guò)KEGG信號(hào)通路富集對(duì)差異基因進(jìn)行分析。對(duì)多個(gè)關(guān)聯(lián)基因構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，除去孤立無(wú)互作的蛋白，構(gòu)建出30個(gè)基因組成的PPI網(wǎng)絡(luò)。分析結(jié)果提示TRPC5與炎癥基因蛋白IL-2、IL-6、IL-10以及IL-18等都有相關(guān)性(Fig 1)。

Fig 1 PPI protein network related to TRPC5

2.1.2GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析 提取核心基因，運(yùn)用GO功能及KEGG信號(hào)通路富集對(duì)這些基因進(jìn)行分析。其中，GO功能富集結(jié)果提示核心基因在生物學(xué)過(guò)程中的主要富集在細(xì)胞過(guò)程(cellular process)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、信號(hào)傳輸(signaling)、免疫系統(tǒng)過(guò)程(immune system process)等17個(gè)生物學(xué)過(guò)程中。在細(xì)胞組成中主要富集在細(xì)胞(cell)、膜(membrane)、胞外區(qū)(extracellular region)等8個(gè)部分。分子功能主要富集在轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)(transporter activity)、信號(hào)換能器活動(dòng)(signal transducer activity)等5個(gè)活動(dòng)(Fig 2)。由此可見TRPC5除作為鈣離子通道進(jìn)行生物信號(hào)傳導(dǎo)外，還參與了生物調(diào)節(jié)和免疫系統(tǒng)過(guò)程。

KEGG信號(hào)通路主要富集在MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、cGMP-PKG信號(hào)通路(cGMP-PK G signaling pathway)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NF-κB信號(hào)通路(NF-κB signaling pathway)等二十個(gè)信號(hào)通路(Fig 2)。可推斷TRPC5基因參與了生物免疫過(guò)程，或與炎癥過(guò)程密切相關(guān)。

Fig 2 GO function enrichment map of TRPC5 gene Through biological process,cell composition and molecular function wereanalyzed for correlation.

Fig 3 KEGG function enrichment map of TRPC5 gene

2.2 生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1小鼠基因型檢測(cè) 提取小鼠心臟組織RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)TRPC各亞型表達(dá)情況，結(jié)果顯示TRPC5基因在TRPC5-/-小鼠心臟組織中不表達(dá)(Fig 4)。

2.2.2小鼠體質(zhì)量及血糖變化 對(duì)比各組小鼠血糖及體質(zhì)量(Fig 5)，高糖組比對(duì)照組體質(zhì)量減輕，血糖水平明顯升高(P<0.05)。雖然兩種小鼠間血糖差異無(wú)顯著性，但與對(duì)照組相比，C57BL/6J小鼠高糖組比TRPC5-/-高糖組體質(zhì)量減輕更多，血糖也升高更多，證明TRPC5基因敲除后可在一定程度上抑制糖尿病造成的體質(zhì)量減輕癥狀。

Fig 4 Expression of TRPC subtypes in mouse heart tissue,GAPDH as internal reference control

Fig 5 Body weight and blood glucose n=5)1：TRPC5-/- CON；2：TRPC5-/- HG；3：C57BL/6J CON;4:C57BL/6J HG;*P<0.05,**P<0.01 vs TRPC5-/- CON;##P<0.01 vs C57BL/6J CON;$$P<0.01 vs TRPC5-/- HG.

2.2.3心肌切片染色結(jié)果 從HE染色結(jié)果(Fig 6)可看出，對(duì)比正常組，C57BL/6J小鼠和TRPC5-/-小鼠高糖組心肌組織細(xì)胞排列更加松散，病變區(qū)域更多。從Masson染色(Fig 7)可看出，與對(duì)照組相比，模型組的心肌組織膠原纖維浸潤(rùn)更多，心肌炎癥程度更嚴(yán)重。此外，TRPC5-/-小鼠高糖組比C57BL/6J小鼠高糖組膠原纖維浸潤(rùn)相對(duì)減少，提示抑制TRPC5基因能在一定程度上減緩糖尿病性心肌病的心肌炎癥損傷。

Fig 6 HE staining of paraffin sections of mouse myocardium (100×)A:C57BL/6J normal;B:C57BL/6J high glucose;C:TRPC5-/- normal;D:TRPC5-/- high glucose.

Fig 7 Masson staining of paraffin sections of mouse myocardium (100×)A:C57BL/6J normal;B:C57BL/6J high glucose;C:TRPC5-/- normal;D:TRPC5-/- high glucose.

2.2.4炎癥細(xì)胞因子RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組中相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18以及INF-α的表達(dá)均明顯升高(P<0.05或0.01)。空白組中TRPC5-/-小鼠IL-6和IL-10都與C57小鼠無(wú)差異，在此基礎(chǔ)上，TRPC5-/-模型組小鼠IL-1β、IL-6、IL-10及IL-18表達(dá)均低于C57BL/6J模型組小鼠(P<0.05,Fig 8)。提示TRPC5基因敲除后，一定程度上抑制了糖尿病病理?xiàng)l件下心肌組織炎癥反應(yīng)。

2.2.5小鼠血清ELISA檢測(cè) 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，兩種模型組小鼠血清中相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-2的含量均升高(P<0.05或0.01)，與RT-PCR結(jié)果相呼應(yīng)?？瞻捉M中TRPC5-/-小鼠IL-2和IL-6都與C57小鼠差異無(wú)顯著性，而模型組中，TRPC5-/-小鼠的炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-2含量均低于C57BL/6J小鼠(P<0.05或0.01，F(xiàn)ig 9 A，B)。

小鼠血清測(cè)定結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中的CK、CK-MB、MB以及cTn-I含量均高于對(duì)照組小鼠(P<0.05)，即高糖造模后小鼠的心肌損傷嚴(yán)重?？瞻捉M中以上檢測(cè)指標(biāo)在兩種小鼠中差異均無(wú)顯著性，此基礎(chǔ)上C57BL/6J模型組小鼠的CK、CK-MB和MB含量高于TRPC5-/-模型組(P<0.05,Fig 9 C，D)，提示抑制TRPC5基因可明顯改善心肌損傷程度。

2.2.6小鼠心肌Western blot實(shí)驗(yàn) 取各組小鼠心臟組織提取蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，從統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig 10可看出，C57BL/6J小鼠心肌組織中表達(dá)TRPC5蛋白，且造模后表達(dá)明顯升高(P<0.001)。同時(shí)，造模后IL-1β、IL-6表達(dá)升高(P<0.05)，但TRPC5-/-小鼠高糖組中，IL-1β升高不明顯，提示抑制TRPC5基因的表達(dá)能一定程度抑制炎癥的發(fā)展。

2.3 小鼠原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.3.1乳鼠原代心肌細(xì)胞鑒定結(jié)果 乳鼠的原代心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物 α-sarcomeric antibody 通過(guò)一抗和二抗特異性結(jié)合后呈現(xiàn)綠色熒光(Fig 11a、d)，心肌細(xì)胞的細(xì)胞核與染料 DAPI 結(jié)合后呈現(xiàn)藍(lán)色熒光(Fig 11b、e)，各組經(jīng)重疊后鑒定為乳鼠原代心肌細(xì)胞(Fig 11)。

Fig 8 Expression of various inflammatory factors and TRPC5 in mouse myocardium n=3)1：TRPC5-/- CON；2：TRPC5-/- HG；3：C57BL/6J CON;4:C57BL/6J HG;*P<0.05,**P<0.01 vs TRPC5-/- CON;##P<0.01 vs C57BL/6J CON;$P<0.05,$$P<0.01 vs TRPC5-/- HG.

Fig 9 Detection of myocardial enzymes and inflammatory factors in serum of mice n=5)(A-B)Serum levels of IL-1β,IL-6,IL-2 and IFN-γ respectively.(C-D)Serum levels of CK,CK-MB,MB,and cTn-I,respectively.1：TRPC5-/- CON；2：TRPC5-/- HG；3：C57BL/6J CON;4:C57BL/6J HG;*P<0.05,**P<0.01 vs TRPC5-/- CON;#P<0.05,##P<0.01 vs C57BL/6J CON;$P<0.05,$$P<0.01 vs TRPC5-/- HG.

2.3.2小鼠心肌細(xì)胞RT-PCR結(jié)果 高糖培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基并進(jìn)行交換，繼續(xù)培養(yǎng)后檢測(cè)各組炎癥因子以及TRPC5的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并進(jìn)行對(duì)比。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TRPC5-/-小鼠高糖組IL-10、IL-18及INF-α 3種炎癥因子表達(dá)幾乎無(wú)變化。而C57BL/6J高糖交換組IL-10、IL-18以及INF-α顯著升高，且IL-1β與IL-6升高也較TRPC5-/-高糖交換組更為明顯。表明TRPC5基因抑制后能夠一定程度降低心肌細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，即減輕炎癥反應(yīng)。

巨噬細(xì)胞得到心肌細(xì)胞高糖組的細(xì)胞液后，炎癥因子的表達(dá)均顯著升高，提示高糖刺激后的心肌細(xì)胞釋放于細(xì)胞培養(yǎng)液中的某些細(xì)胞因子能使巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)升高(Fig 12)。

Fig 10 WB test results in mice n=5)(A-B)TRPC5,IL-1β,IL-2 and IL-6 protein expression respectively.1：TRPC5-/- CON；2：TRPC5-/- HG；3：C57BL/6J CON;4:C57BL/6J HG;*P<0.05 vs TRPC5-/- CON;#P<0.05,##P<0.01 vs C57BL/6J CON.

Fig 11 Results of using α-sarcomeric antibody to identify primary cardiomyocytes of neonatal rats in C57BL/6J (a,b,c)and TRPC5-/- mice (d,e,f)

Fig 12 Expression detection of mouse primary cardiomyocytes and mouse macrophages after exchanging culture medium n=3)A:IL-1β,TRPC5 gene expression;B:IL-6,IL-10 gene expression;C:IL-18,INF-α gene expression.1:TRPC5-/- CON;2 TRPC5-/- HG+EX;3:C57BL/6J CON;4:C57BL/6J HG+EX;5:macrophage CON;6:macrophage HG+EX TRPC5-/- HG;7:macrophage HG+EX C57BL/6J HG;**P<0.01 vs TRPC5-/- CON;##P<0.01 vs C57BL/6J CON;$$P<0.01 vs TRPC5-/- HG+EX;&&P<0.01 vs macrophage CON.

2.4 結(jié)論生物信息學(xué)對(duì)核心基因所具有調(diào)控作用的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能和信號(hào)通路進(jìn)行注釋，使用關(guān)聯(lián)基因構(gòu)建出其蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，明確了TRPC5相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程以及相關(guān)的重要基因，發(fā)現(xiàn)TRPC5參與了免疫學(xué)過(guò)程，與炎癥相關(guān)基因以及通路具有關(guān)聯(lián)性。

TRPC5基因敲除后，小鼠在相同的造模條件下，體重以及血糖的變化較正常小鼠更少，且因糖尿病性心肌病造成的心肌損傷及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)都有所減少，明確了TRPC5通道與心肌細(xì)胞的炎癥的相關(guān)性，即敲除后可以改善心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少心肌組織損傷。

通過(guò)小鼠血清檢測(cè)以及炎癥相關(guān)的蛋白和基因表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TRPC5基因敲除后可減少在糖尿病狀態(tài)下小鼠血清中的炎癥因子以及肌酸激酶等的分泌量，改善小鼠心肌組織的基因表達(dá)升高狀況和心肌損傷程度，另外心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)高糖刺激后所釋放的某種細(xì)胞因子可能使巨噬細(xì)胞的炎癥表達(dá)升高。

3 討論

在心肌炎癥中，心肌細(xì)胞以及免疫細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子形成的抗炎機(jī)制對(duì)維持心肌功能和研究心肌炎發(fā)病通路具有重要的作用[11-12]。心肌炎(myocarditis)是由于多種原因造成的心肌損傷后，免疫炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)至心肌組織，從而造成的炎癥疾病。伴隨著炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子TNF-α、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ等的表達(dá)量升高[13]，心肌組織的持續(xù)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致了心肌組織損傷和心肌細(xì)胞的凋亡壞死，部分患者最終可演變?yōu)閿U(kuò)張性心肌病和慢性心臟損傷，具有較高的發(fā)病率和致死率[14]。炎癥反應(yīng)的增加是DCM的重要發(fā)病機(jī)制之一，大量炎癥因子的釋放可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化，影響心功能。作為糖尿病并發(fā)癥的心肌炎研究具有重要意義。

有研究證明，多種TRP亞型的表達(dá)在1型及2型糖尿病病人及動(dòng)物的組織中(如腎臟、血管及炎癥細(xì)胞)均發(fā)生明顯的改變[15]，這些結(jié)果提示TRPC在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。近年來(lái)研究亦發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞自噬對(duì)在糖尿病性心肌病(DCM)病變進(jìn)程有重要的作用[16]。而自噬與炎癥密切關(guān)聯(lián)，自噬對(duì)炎癥反應(yīng)的雙向調(diào)節(jié)功能在促炎和抗炎反應(yīng)中都發(fā)揮重要作用[17]。在前期TRPC5對(duì)心肌細(xì)胞自噬調(diào)控研究的基礎(chǔ)上，本論文在整體動(dòng)物及細(xì)胞水平對(duì)TRPC5基因通過(guò)干預(yù)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與DCM發(fā)生發(fā)展過(guò)程的作用進(jìn)行了全面探討。

在生物信息學(xué)方面，分析了TRPC5相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程及重要基因，提示TRPC5確實(shí)參與免疫學(xué)過(guò)程，也與炎癥相關(guān)基因具有關(guān)聯(lián)性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，發(fā)現(xiàn)TRPC5基因敲除后，糖尿病造成的炎癥反應(yīng)及心肌損傷都有所減輕，明確了TRPC5通道與心肌細(xì)胞的炎癥調(diào)控有關(guān)，證實(shí)其敲除后可以減輕心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)高血糖后炎癥細(xì)胞內(nèi)TRPC5表達(dá)的增高，提示TRPC5可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分，對(duì)上述推論進(jìn)行了驗(yàn)證。后續(xù)研究中將繼續(xù)對(duì)TRPC5基因調(diào)控糖尿病性心肌病的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期助力于開發(fā)新的治療糖尿病性心肌病的靶點(diǎn)及藥物。