王艷紅，田繼華，楊 佳，薛 媛，張婷婷，于培霞

(1.山西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，山西 晉中 030600；2.山西白求恩醫(yī)院檢驗(yàn)科，山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，同濟(jì)山西醫(yī)院，山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，山西 太原 030032；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030)

巨噬細(xì)胞是人體重要的固有免疫細(xì)胞之一，有高度異質(zhì)性和可塑性，在不同微環(huán)境刺激下可極化為M1和M2型[1]。巨噬細(xì)胞極化對(duì)多種疾病的病理有重要影響。M1/M2型巨噬細(xì)胞比例失衡是許多炎癥性疾病的病理標(biāo)志，如肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化等，并與腫瘤預(yù)測(cè)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有重要關(guān)系。因此，巨噬細(xì)胞M1/M2的動(dòng)態(tài)平衡在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中具有重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4活化后，M1型巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)作用，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatiod arthritis，RA)等自身免疫病的發(fā)病過(guò)程中起決定性促進(jìn)作用[2]，而抑制M1型巨噬細(xì)胞的促炎效應(yīng)則會(huì)恢復(fù)組織穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)炎癥轉(zhuǎn)歸[3]。因此深入探索巨噬細(xì)胞極化所涉及的分子信號(hào)機(jī)制可能為臨床治療相關(guān)疾病提供新的治療靶點(diǎn)[3]。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一種酶復(fù)合體，是重要的細(xì)胞代謝感受器，調(diào)節(jié)能量代謝，在炎癥反應(yīng)中也起到調(diào)節(jié)作用[4]，研究報(bào)道AMPK可促進(jìn)抗炎性的M2巨噬細(xì)胞極化[5]。Wang等[6]用二甲雙胍治療癌癥時(shí)，激活A(yù)MPK途徑可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化。中介素(intermedin，IMD)屬于降鈣素基因相關(guān)肽家族成員，是一種具有潛在器官保護(hù)作用的內(nèi)源性多肽[7]，大量研究表明IMD具有抗氧化、抑制炎癥、心臟保護(hù)，減輕急性腎損傷等作用。本研究組前期研究證實(shí)IMD能顯著減輕炎性反應(yīng)，下調(diào)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)等致炎因子的表達(dá)[8]。Chiang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，IMD1-53通過(guò)激活A(yù)MPK途徑，增強(qiáng)血管生成并減輕心肌梗塞后的不良重塑；抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而防止心臟肥大；逆轉(zhuǎn)同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1/M2比例的失調(diào)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化[10]。但其對(duì)巨噬細(xì)胞極化進(jìn)程中涉及的具體分子機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7，研究IMD對(duì)其炎癥分子的表達(dá)及極化表型的影響，以探討IMD調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7(上海細(xì)胞庫(kù))，IMD1-53(美國(guó)phoenix公司)，LPS、Compound C(美國(guó)Sigma公司)，兔抗TNF-α(ab183218)、IL-6(ab214429)和IL-10(ab189392)(美國(guó)Abcam公司)，兔抗p-AMPK(2537)和AMPK(2532)(美國(guó)CST公司)。TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(美國(guó)Cusabio公司)，APC-anti CD86(105011，美國(guó)Biolegend公司)。

1.2 細(xì)胞分組取傳代 3～4代的 RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、LPS處理組(1 mg·L-1LPS處理4 h)，IMD+LPS處理組(預(yù)先用20 μg·L-1IMD處理巨噬細(xì)胞2 h，再加入1 mg·L-1LPS處理4 h)，AMPK抑制劑Compound C組(LPS+IMD+CC)：預(yù)先用AMPK抑制劑Compound C 1 μmol·L-1處理1 h，余同IMD+LPS組。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1Real time PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá) TRIzol法提取總RNA，取1 μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見Tab 1，按照SYBR Green PCR matter mix說(shuō)明書進(jìn)行realtime PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為95 ℃,30 s預(yù)變性；5 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)，數(shù)據(jù)按2-ΔΔCt的方法分析相對(duì)濃度。

Tab 1 Primer sequences

1.3.2Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 裂解細(xì)胞提取胞質(zhì)蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉(5%脫脂奶粉)1 h。分別加入一抗TNF-α(1 ∶1 000)、IL-6(1 ∶2 000)、IL-10(1 ∶1 000)、p-AMPK(1 ∶1 000)和AMPK(1 ∶1 000)于4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后加入羊抗兔抗體(1 ∶5 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，應(yīng)用Quantity One分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化特征性分子 收集細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS清洗，4 ℃ 1 000 r·min-1離心 5 min，棄上清；加入100 μL染色緩沖液(1% BSA-PBS)中重懸，加入流式抗體APC-anti CD86，4 ℃避光孵育1 h，緩沖液洗滌3次，離心，500 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4ELISA 法測(cè)定IL-6、TNF-α濃度 收集細(xì)胞懸液，4 ℃ 2 000 r·min-1離心10 min，收集上清-20 ℃保存，IL-6、TNF-α按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 IMD對(duì)AMPK信號(hào)通路的影響采用Western blot法檢測(cè)了p-AMPK及AMPK蛋白表達(dá)，結(jié)果如Fig 1所示。與對(duì)照組及LPS組比較，IMD處理組可見p-AMPK表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)，且p-AMPK/AMPK比值也上調(diào)，提示IMD對(duì)AMPK通路有激活作用。

Fig 1 The protein levels of p-AMPK and AMPK in different groups determined by Western blot n=3)**P<0.01 vs control，##P<0.01 vs LPS，△△P<0.01 vs LPS+IMD

2.2 IMD對(duì)巨噬細(xì)胞M1/M2型標(biāo)志因子mRNA表達(dá)的影響由Fig 2可見，LPS刺激RAW264.7細(xì)胞導(dǎo)致M1型標(biāo)志分子CD86、TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)升高，M2型標(biāo)志分子CD206、Arg-1 mRNA表達(dá)降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果表示LPS可誘導(dǎo)其向M1型極化；與LPS組比較，IMD處理可降低CD86、TNF-α、iNOS mRNA的表達(dá)，增加CD206、Arg-1 mRNA表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；而AMPK抑制劑Compound C處理可在一定程度上拮抗這一作用(P<0.05，P<0.01)。

Fig 2 The mRNA levels of M1/M2 in different groups determined by Real time PCR n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs control；#P<0.05，##P<0.01 vs LPS；△P<0.05，△△P<0.01 vs LPS+IMD

2.3 IMD對(duì)巨噬細(xì)胞M1/M2型標(biāo)志因子蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果可見，LPS組促炎因子TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)升高，而抗炎因子IL-10蛋白表達(dá)降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與LPS組比較，IMD處理可降低TNF-α、IL-6的表達(dá)，增加IL-10表達(dá)；而AMPK抑制劑Compound C處理可在一定程度上拮抗這一作用(P<0.01)。

2.4 IMD對(duì)M1型巨噬細(xì)胞比例的影響Fig 4的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組M1型細(xì)胞比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與LPS組相比，IMD處理組M1型細(xì)胞減少(P<0.01)；與LPS+IMD組比較，AMPK抑制劑Compound C處理組M1型細(xì)胞增加(P<0.05)，提示AMPK信號(hào)通路在IMD抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化過(guò)程中發(fā)揮一定作用。

2.5 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的改變由Fig 5可見，ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-6分泌情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS處理可導(dǎo)致TNF-α、IL-6分泌增加(P<0.01)，經(jīng)IMD處理后，細(xì)胞因子的分泌明顯減少(P<0.01)，與IMD組相比，AMPK抑制劑Compound C處理組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的分泌量增加(P<0.05)。

Fig 3 The protein levels of TNF-α,IL-6 and IL-10 in different groups determined by Western blot n=3)**P<0.01 vs control；##P<0.01 vs LPS；△△P<0.01 vs LPS+IMD

Fig 4 Proportion of M1 in RAW264.7 detected by flow cytometry n=3)**P<0.01 vs control；##P<0.01 vs LPS；△P<0.05 vs LPS+IMD

Fig 5 Secretion of TNF-α and IL-6 in different groups detected by ELISA n=3)**P<0.01 vs control；##P<0.01 vs LPS；△P<0.05 vs LPS+IMD

3 討論

大量的研究表明，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞參與了炎癥性疾病如自身免疫病、超敏反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。巨噬細(xì)胞不僅能吞噬和殺滅病原微生物，還能生產(chǎn)多種促炎性細(xì)胞因子和趨化因子參與過(guò)敏性哮喘、RA、急性呼吸窘迫綜合征等炎癥性疾病的致病過(guò)程[1]。巨噬細(xì)胞極具異質(zhì)性和可塑性，可因微環(huán)境不同而轉(zhuǎn)換為多種亞型。在LPS或干擾素(interferon，IFN-γ)等刺激下分化為M1型巨噬細(xì)胞，釋放白介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、TNF-α等促炎因子，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)高表達(dá)，促進(jìn)炎癥的發(fā)展；在IL-4、IL-13等信號(hào)刺激下可活化為M2型巨噬細(xì)胞，高表達(dá)精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)、CD206、YM-1，分泌IL-10等抗炎因子，具有抗炎、促組織修復(fù)的作用[10-12]。RA患者的滑膜巨噬細(xì)胞呈M1促炎性極化表型，滑液巨噬細(xì)胞M1/M2比例顯著升高，以M1型巨噬細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)[13]。活化的M1巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出促炎活性，并導(dǎo)致多種炎癥性疾病，如微生物感染、敗血癥、自身免疫性疾病和心臟代謝疾病[14]，巨噬細(xì)胞 M1/M2極化在多種疾病如腫瘤、炎癥、腦卒中、心血管疾病等的發(fā)病及進(jìn)展中都至關(guān)重要，通過(guò)調(diào)節(jié)M1/M2型巨噬細(xì)胞極化可有效控制相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展，改善其預(yù)后[1]。

IMD是重要的心、腎、神經(jīng)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)肽，參與多種器官生理、病理過(guò)程[6-7]，Pang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，IMD可逆轉(zhuǎn)同型半胱氨酸血癥(Hcy)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1/M2比例的失調(diào)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化。本研究采用體外培養(yǎng)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，通過(guò)LPS誘導(dǎo)模擬巨噬細(xì)胞受到的炎性刺激，結(jié)果顯示，LPS可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞朝M1型分化，上調(diào)細(xì)胞因子TNF-α，IL-6的表達(dá)，增加M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量；而IMD處理可減少細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌，下調(diào)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子CD86、TNF-α、iNOS的表達(dá)，使M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子CD206、Arg-1、IL-10表達(dá)上調(diào)，同時(shí)減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞比例，進(jìn)一步證實(shí)了IMD可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞M1型極化，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化進(jìn)程。

AMPK是參與細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵激酶，AMPK激活后通過(guò)抑制糖酵解、促進(jìn)氧化磷酸化，改變炎癥細(xì)胞抗炎表型，對(duì)炎癥發(fā)揮抑制作用。AMPK激活抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和系膜細(xì)胞促炎細(xì)胞因子表達(dá)[15-16]，近年來(lái)研究顯示,在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中AMPK通路參與了M2型巨噬細(xì)胞的活性，并減輕了LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和肺損傷，而AMPK-/-巨噬細(xì)胞不能被誘導(dǎo)活化為M2型巨噬細(xì)胞[17]。在造血干細(xì)胞中抑制AMPK信號(hào)通路可促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞活化，抑制M2型巨噬細(xì)胞活化[18]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證實(shí)，LPS作用巨噬細(xì)胞RAW264.7后，p-AMPK蛋白水平下降，而IMD處理后可增加p-AMPK蛋白水平。我們采用Compound C阻斷AMPK活性，抑制AMPK信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)量升高并增強(qiáng)了LPS的作用。結(jié)果提示IMD可以上調(diào)p-AMPK表達(dá)，激活A(yù)MPK信號(hào)通路，減少LPS導(dǎo)致的RAW264.7細(xì)胞M1型極化。IMD通過(guò)與降鈣素受體樣受體/受體活化修飾蛋白復(fù)合物共同受體(calcitonin receptor-like receptor/receptor activity modifying protein receptor complexes，CRLR/RAMPs)結(jié)合增加細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生，進(jìn)而激活A(yù)MPK信號(hào)通路[10]，但其具體調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究證實(shí)IMD可能通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的M1型極化及炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，以上研究為IMD通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，參與巨噬細(xì)胞極化失衡導(dǎo)致的相關(guān)免疫炎癥性疾病的診斷和治療提供了新的思路。