金昱彤，祁 琳，牛芯蕊，王繼達(dá)，于 爽，李佳穎，邊育紅，王 越

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617；2.武警特色醫(yī)學(xué)中心藥劑科，天津 300162)

成骨細(xì)胞調(diào)控的骨形成環(huán)節(jié)與破骨細(xì)胞調(diào)控的骨吸收環(huán)節(jié)發(fā)揮協(xié)同作用，共同維持著骨穩(wěn)態(tài)，與骨流失相關(guān)的骨骼疾病，如骨質(zhì)疏松，是由于成骨細(xì)胞的功能受損，進(jìn)而骨穩(wěn)態(tài)失衡造成[1]。成骨細(xì)胞骨形成功能的低下可加速骨吸收作用，導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡，降低骨密度，增加骨脆性，從而引發(fā)骨質(zhì)疏松[2]。因此，使用有效的藥物促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并提高骨形成能力是治療骨質(zhì)疏松病的關(guān)鍵。

中藥紅景天系景天科大花紅景天的干燥根莖，具有益氣活血的功效。其中，紅景天苷(salidroside，SAL)是紅景天中的主要有效活性成分，有低毒性和低副作用的特性。近年來(lái)，因其具有抗缺氧、抗骨質(zhì)疏松、神經(jīng)保護(hù)及抗癌等藥理學(xué)作用而受到廣泛關(guān)注[3-4]。在抗骨質(zhì)疏松研究方面，SAL能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制成骨細(xì)胞的氧化損傷及骨吸收因子的釋放從而減少骨量的丟失[5]。最新研究表明，SAL通過(guò)激活Wnt/BMP 信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而起到抗骨質(zhì)疏松的作用[6]。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)與促進(jìn)骨形成、血管新生，改善骨折愈合有著密切關(guān)系[7]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4)及白介素6 (interleukin 6，IL-6)均為HIF-1α的下游靶基因，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和骨血管生成的作用[8-10]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，SAL可通過(guò)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路促進(jìn)骨折愈合，促進(jìn)小鼠骨形成功能[11]。本研究以小鼠原代細(xì)胞(mouse primary osteoblasts，MOB)為研究對(duì)象，進(jìn)一步探究SAL促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑紅景天苷(純度≥98%，N11O9X71936)購(gòu)于上海源葉生物有限公司；YC-1(81560)購(gòu)于Cayman Chemica公司；胰酶(T1320)、Ⅰ型膠原酶(C8140)、ALP染色試劑盒(G1481)均購(gòu)于Solarbio公司；α-MEM培養(yǎng)基(SH30265.01)購(gòu)于Hyclone公司；胎牛血清(S711-001S)購(gòu)于Lonsera公司；青鏈霉素(15140-122)購(gòu)于Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒(CW00145)、HiFi Script cDNA Synthesis Kit(CW2569M)均購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司；HIF-1α抗體(ab2185，1 ∶1 000)、GAPDH抗體(ab181602，1 ∶10 000)均購(gòu)于Abcam公司；TransStart TopGreen qPCR SuperMix(AQ601-03)購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；HIF-1α、VEGF、ANGPTL4 、IL-6mRNA引物均購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；VEGF(YX-220513M)、ANGPTL4(YX-011407M)、IL-6(YX-091206M)ELISA試劑盒購(gòu)于天津伊特生命科學(xué)研發(fā)有限公司

1.2 主要儀器超凈工作臺(tái)，Heal Force公司；CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀Thermo公司；倒置顯微鏡，NIKON公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生48 h內(nèi)的C57/BL6乳鼠10只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。

2 方法

2.1 原代成骨細(xì)胞的提取將新生乳鼠用酒精浸泡消毒后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)剝離出顱蓋骨，置于含青鏈霉素的PBS中，剔除組織后剪碎并置于新的培養(yǎng)瓶中。采用胰酶-Ⅰ型膠原酶聯(lián)合消化剪碎的骨片，收集膠原酶消化液離心后收集細(xì)胞沉淀，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，差速貼壁法純化提取的MOB，取2～5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 原代成骨細(xì)胞的鑒定將第2代原代成骨細(xì)胞PBS漂洗兩次后，用4%細(xì)胞固定液固定30 min，配制ALP染色溶液并依次加入，在37 ℃恒溫孵育箱避光孵育60 min，PBS漂洗后顯微鏡下觀察。

2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，調(diào)整MOB細(xì)胞濃度后接種于96孔板中，每個(gè)濃度SAL設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48和72 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)各孔OD值。

2.4 Western blot檢測(cè)用Western blot法檢測(cè)在加入1～1 000 nmol·L-1SAL后細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白HIF-1α的表達(dá)變化，按說(shuō)明書比例配制含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解后按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書測(cè)定樣品濃度。隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉孵育后顯影，用ImageJ分析條帶，使用GraphPad Prism8作圖。

Tab 1 List of primers

2.5 RT-PCR檢測(cè)使用TRIzol提取法提取Control組和SAL干預(yù)組(1、10、100、1 000 nmol·L-1)細(xì)胞總RNA，檢測(cè)濃度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。隨后使用SYBR qPCR SuperMix進(jìn)行熒光定量PCR，實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用相對(duì)定量法分析，運(yùn)用2-ΔΔCT的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2.6 ELISA檢測(cè)收集Control組及SAL干預(yù)組(1、10、100、1 000 nmol·L-1)的細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，依次加入樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，檢測(cè)上清液中VEGF、ANGPTL4及IL-6的水平情況。

2.7 藥物干預(yù)與分組取正常培養(yǎng)的2-5代MOB，分Control組，SAL干預(yù)組(1、10 、100、1 000 nmol·L-1)，SAL干預(yù)組給予SAL處理48 h，Control組采用α-MEM完全培養(yǎng)基對(duì)照，加入HIF-1α阻斷劑YC-1(10 μmol·L-1)，預(yù)處理1 h。

3 結(jié)果

3.1 原代成骨細(xì)胞的培養(yǎng)將提取后的MOB于24 h、72 h和5 d在鏡下觀察，可見(jiàn)提取后24 h的成骨細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、胞核呈卵圓形，72 h時(shí)形態(tài)呈現(xiàn)為梭形，且細(xì)胞之間接觸增多、胞體向外伸展，5 d后細(xì)胞形態(tài)多呈三角樣、紡錘樣，待長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3.3 SAL對(duì)小鼠原代成骨細(xì)胞增殖的影響使用不同濃度(1、10、100、1 000 nmol·L-1)的SAL分別作用MOB 24、48和72 h后，采用MTT法檢測(cè)在3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)時(shí)SAL對(duì)MOB增殖的影響。結(jié)果如Fig 3所示，與Control組相比，24、48和72 h時(shí)SAL干預(yù)組均促進(jìn)MOB的增殖，其中48 h開始增殖效果明顯，以100 nmol·L-1的SAL增殖效果最佳(P<0.01)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)SAL濃度選擇1～1 000 nmol·L-1，并選用48 h為藥物作用時(shí)間。

Fig 1 Adherent primary osteoblasts in different growth stages

Fig 2 Alkaline phosphatase staining of second passage of MOB(100×)

Fig 3 Effects of SAL on proliferation of MOB

3.4 SAL對(duì)原代成骨細(xì)胞HIF-1α通路相關(guān)基因表達(dá)的影響為考察SAL對(duì)MOB中HIF-1α信號(hào)通路的影響，采用RT-PCR法檢測(cè)HIF-1α及通路中相關(guān)基因VEGF、ANGPTL4及IL-6表達(dá)水平的變化。結(jié)果如Fig 4所示，在加入SAL干預(yù)MOB后，與Control組相比，SAL干預(yù)組HIF-1α、VEGF、ANGPTL4及IL-6 mRNA表達(dá)均有不同程度上調(diào)，其中100 nmol·L-1的SAL干預(yù)組最明顯(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SAL可能經(jīng)HIF-1α/VEGF、ANGPTL4、IL-6信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞。

Fig 4 Effects of SAL on HIF-1α,VEGF,ANGPTL4,IL-6

3.5 SAL對(duì)HIF-1α通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為進(jìn)一步驗(yàn)證SAL對(duì)成骨細(xì)胞HIF-1α通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，采用Western blot法檢測(cè)了在加入SAL后HIF-1α蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果如Fig 5顯示，與Control組相比，SAL干預(yù)組HIF-1α蛋白表達(dá)水平上調(diào)，且當(dāng)SAL濃度為100 nmol·L-1時(shí)最為明顯(P<0.01)。在加入濃度為1～1 000 nmol·L-1的SAL后，使用ELISA法對(duì)上清液中的VEGF、ANGPTL4、IL-6檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，SAL干預(yù)組VEGF、ANGPTL4及IL-6的分泌含量均有不同程度增加。

3.6 HIF-1α阻斷劑YC-1對(duì)SAL作用后HIF-1α通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響在加入SAL前使用HIF-1α阻斷劑YC-1提前處理MOB 1 h，選用100 nmol·L-1濃度的SAL同時(shí)設(shè)立阻斷劑對(duì)照組，檢測(cè)HIF-1α及VEGF、ANGPTL4及IL-6的蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 6顯示，與Control組相比，YC-1對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，在加入100 nmol·L-1SAL后蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。與SAL干預(yù)組相比，YC-1+SAL組HIF-1α、VEGF、ANGPTL4及IL-6的蛋白表達(dá)均下調(diào)，由此可見(jiàn)SAL對(duì)MOB的作用有部分經(jīng)HIF-1α/VEGF、ANGPTL4、IL-6信號(hào)通路調(diào)控。

Fig 5 Effect of SAL on protein expression level of HIF-1α,*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 6 Effects of YC-1 on protein expression level of HIF-1α,*P<0.05,**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs SAL group

4 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種由骨穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致的慢性疾病，尤以老年人和絕經(jīng)后婦女為高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)病人群[12]，與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失和骨質(zhì)疏松病與成骨細(xì)胞數(shù)量減少密切相關(guān)。成骨細(xì)胞來(lái)源于骨間充質(zhì)干細(xì)胞，主要功能為調(diào)控骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化[13]。成骨細(xì)胞骨形成功能的低下可加速骨質(zhì)流失，而促進(jìn)骨形成的重要靶點(diǎn)在于提高對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化功能的調(diào)控。

HIF-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，其組成包括α和β兩個(gè)亞基，HIF-1α信號(hào)通路與促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成功能密切相關(guān)，激活HIF-1a和骨生成相關(guān)基因可改善骨折愈合、增加骨礦物質(zhì)密度并增加骨強(qiáng)度[14]，小鼠骨形成能力隨著特異性敲除成骨細(xì)胞HIF-1α基因后顯著減弱[15]。有研究通過(guò)建立兩階段細(xì)胞譜系數(shù)學(xué)模型的方法分析HIF-1α對(duì)MSCs成骨分化的影響，結(jié)果顯示，HIF-1α對(duì)MSCs的成骨分化率具有劑量依賴性刺激作用[16]。

現(xiàn)有研究表明，VEGF、ANGPTL4和IL-6均為HIF-1α的下游靶基因，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和骨血管生成的作用。VEGF是促進(jìn)骨血管生成的因子，成骨細(xì)胞中HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的激活，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、加速血管生成，對(duì)骨折的治療起關(guān)鍵作用[8,17]。ANGPTL4是一種多功能脂肪因子，參與血管生成。Knowles等[9]應(yīng)用DNA芯片分析發(fā)現(xiàn)ANGPTL4為HIF-1α下游的首要靶基因，且證實(shí)ANGPTL4可增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖和分化。IL-6是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，HIF-1α過(guò)表達(dá)可顯著提高成骨細(xì)胞中IL-6的水平，外源性IL-6可以顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，提示成骨細(xì)胞中的IL-6為HIF-1α下游靶基因，并通過(guò)HIF-1α途徑促進(jìn)血管生成-成骨耦聯(lián)[10]。

本實(shí)驗(yàn)選用源于MOB作為研究對(duì)象，提取時(shí)采用酶消化去除大部分存在于骨膜中的軟骨細(xì)胞。通過(guò)傳代和差異性貼壁法對(duì)提取的細(xì)胞進(jìn)行純化后，成骨細(xì)胞為貼壁細(xì)胞的主要組成部分。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同濃度SAL(1～105nmol·L-1)對(duì)MOB的增殖作用，結(jié)果顯示在加入SAL(1～104nmol·L-1)24、48及72 h后可不同程度地促進(jìn)MOB增殖，以100 nmol·L-1的SAL增殖效果最佳。進(jìn)一步采用RT-PCR、Western blot、ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SAL對(duì)HIF-1α/VEGF、ANGPTL4、IL-6信號(hào)通路基因和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明在加入SAL(1～1 000 nmol·L-1)后相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，在加入HIF-1α阻斷劑YC-1后該作用減弱，表明SAL對(duì)MOB的作用有部分經(jīng)過(guò)HIF-1α/VEGF、ANGPTL4、IL-6信號(hào)通路調(diào)控。

綜上所述，SAL可促進(jìn)MOB的增殖，其作用機(jī)制可能是激活HIF-1α/VEGF、ANGPTL4、IL-6信號(hào)通路，促進(jìn)血管生成-成骨耦聯(lián)從而提高成骨細(xì)胞的增殖活性。本研究初步探索了SAL促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及其作用機(jī)制，以期為SAL臨床抗骨質(zhì)疏松用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中藥在臨床中防治骨質(zhì)疏松提供了理論基礎(chǔ)和思路。