劉 娟，葉 樹，謝道俊，王 艷，3，蔡 標(biāo)，3，4

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；4.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥 230012；)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種起病隱匿，進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征是腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)以及廣泛的海馬神經(jīng)細(xì)胞缺失[1]。Tau蛋白是一種正常未折疊的、可溶性較高的微管相關(guān)蛋白，在微管的組裝和穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用，可自然調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性、信號(hào)通路和軸向傳輸[2-3]，從而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞的正常功能，AD病變時(shí)Tau過度磷酸化，Tau單體轉(zhuǎn)化為Tau低聚物誘導(dǎo)Tau聚集為成對(duì)螺旋絲，導(dǎo)致NFTs的形成[4]。NFTs積聚在神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)、軸突和樹突中，因此Tau在AD病變的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[2，5]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AD屬“癡呆”范疇，其病機(jī)為年邁體虛、腦髓失養(yǎng)、痰濁血瘀、痹阻腦絡(luò)導(dǎo)致蒙蔽清竅、神機(jī)失用，益氣補(bǔ)腎、豁痰化瘀為其根本治療大法[6]。近年來研究[7]顯示，中醫(yī)藥以多靶點(diǎn)作用機(jī)制防治AD具有明顯的價(jià)值與優(yōu)勢(shì)，因此從中藥復(fù)方中篩選有效抗AD藥物具有顯著意義。黃蒲通竅膠囊作為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院用于治療AD的制劑，主要由大黃、石菖蒲、人參、川芎、制何首烏、益智仁6味中藥組成，功能益氣補(bǔ)腎、豁痰化瘀。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃蒲通竅膠囊通過調(diào)控鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ(calmodulin-dependent protein kinase Ⅳ，CaMKⅣ)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)-磷脂酶Cγ(phospholipase Cγ，PLCγ)等通路，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制Tau蛋白過度磷酸化，改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力[8-10]。

為了進(jìn)一步闡明黃蒲通竅膠囊治療AD的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射D-半乳糖聯(lián)合雙側(cè)海馬注射Aβ25-35建立AD大鼠模型。黃蒲通竅膠囊干預(yù)后，觀察其對(duì)Wnt/Ca2+通路的調(diào)控作用，進(jìn)一步探討黃蒲通竅膠囊治療AD的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 老齡SD健康雄性大鼠40只，體質(zhì)量250～350 g，購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2019-0003。本實(shí)驗(yàn)獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的批準(zhǔn)。

1.2 藥物 黃蒲通竅膠囊(石菖蒲、益智仁、川芎、制何首烏各20 g，人參10 g，大黃6 g，取其水煎劑放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，批?zhǔn)文號(hào)為皖藥制字 Z20080006，批號(hào) 20160907)：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制備；Aβ25-35(批號(hào) A4559-1MG)：Sigma公司；D-半乳糖：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試劑及儀器 Aβ25-35試劑：Sigma公司，使用前用無菌生理鹽水配成2 mg/mL溶液，在37 ℃恒溫孵育7 d，使其變成凝聚態(tài)；Wnt5兔抗大、小鼠抗體和Frizzled兔抗大、小鼠抗體：Affinity公司；PLCβ兔抗大、小鼠抗體：Novus Biologicals USA；BCA試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司；GAPDH抗體：Abbkine公司。腦立體定位儀：Stoelting；酶標(biāo)儀(Multiskan MK2型)：印度Labsystem；微量注射泵(RWD-202)：瑞沃德公司；RM2016病理切片機(jī)：徠卡儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)：Thermo Scientific公司；光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100)：日本尼康；FCM凝膠成像儀：Protein Simple公司；電泳儀(042BR12088)：Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 分組 將30只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、黃蒲通竅膠囊組(1. 41 g/kg，按照體表面積折算法進(jìn)行折算，相當(dāng)于臨床3倍等效量)，每組10只。

2.2 模型復(fù)制和藥物干預(yù) 除空白組外，其余組別大鼠均腹腔注射100 mg/kg D-半乳糖，每日1次，共42 d。D-半乳糖腹腔注射21 d后，將大鼠固定在腦立體定位儀上，并使用微量注射泵將5 μL(10 μg)Aβ25-35緩慢注入雙側(cè)海馬。以前囟為原點(diǎn)，向后4.4 mm、旁開2.2 mm為穿刺點(diǎn)，進(jìn)針3.0 mm?？瞻捉M注射等量生理鹽水。D-半乳糖處理14 d后，黃蒲通竅膠囊組大鼠根據(jù)體質(zhì)量進(jìn)行灌胃喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖

2.3 取材 大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，于-20 ℃冰箱保存，用于ELISA檢測(cè)。每組取5只大鼠，處死后在冰面上取腦，仔細(xì)分離兩側(cè)海馬組織，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱凍存，用于Western blot檢測(cè)。剩余大鼠麻醉后，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定，取出固定的腦組織，用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。

2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力 腹腔注射D-半乳糖37 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，水溫維持23～27 ℃，每日1次，共6 d。前4 d進(jìn)行訓(xùn)練，將大鼠從四個(gè)象限之一放入水中，面向池壁，記錄在90 s內(nèi)找到平臺(tái)所需的時(shí)間。如果大鼠在90 s內(nèi)沒有找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其到平臺(tái)上并停留20 s幫助記憶。第5天從平臺(tái)對(duì)側(cè)象限將大鼠放入水中，將其找到平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間記錄為逃避潛伏期。在第6天移除平臺(tái)并設(shè)置與導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)相同的參數(shù)。記錄老鼠在目標(biāo)象限的路程及時(shí)間百分比。數(shù)據(jù)的采集和處理由Morris水迷宮圖像自動(dòng)監(jiān)視處理系統(tǒng)完成。

2.5 HE染色觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷情況 每組取4只大鼠的腦組織固定后，通過常規(guī)脫水包埋、切片(厚度約為5 μm)制作腦組織切片后，通過HE染色法，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷情況并拍照。

2.6 Western blot法檢測(cè)海馬組織中Wnt5、Frizzled和PLCβ蛋白表達(dá)水平 取剩下6只大鼠的新鮮海馬組織進(jìn)行總蛋白的提取，采用BCA法對(duì)海馬總蛋白進(jìn)行定量分析，10% SDS-PAGE電泳分離總蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)膜和封閉等流程后，再分別加入兔抗大鼠一抗Wnt5(1∶1 200)、Frizzled(1∶2 000)、PLCβ(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。加入山羊抗兔IgG，再加入ECL顯影劑，最終通過FCM凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光拍照以及數(shù)據(jù)處理。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參灰度值的相對(duì)比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 ELISA法檢測(cè)血清三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)表達(dá)水平 采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IP3表達(dá)水平。具體操作參照試劑盒說明書。

3 結(jié)果

3.1 黃蒲通竅膠囊對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 各組大鼠隨時(shí)間的增加其逃避潛伏期曲線呈下降趨勢(shì)，模型組逃避潛伏期曲線普遍高于其他兩組，且從第4天開始趨于穩(wěn)定。第5天水迷宮結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組比較，黃蒲通竅膠囊組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。見表1。模型組大鼠找到第三象限平臺(tái)的路線較其他兩組明顯延長(zhǎng)。與空白組比較，模型組大鼠在目標(biāo)象限的路程和時(shí)間百分比均顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，黃蒲通竅膠囊組大鼠在目標(biāo)象限的路程和時(shí)間百分比均顯著增加(P<0.05)。見圖2。

表1 黃蒲通竅膠囊對(duì)大鼠第1-5天逃避潛伏期的影響

注：A.空白組；B.模型組；C.黃蒲通竅膠囊組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 黃蒲通竅膠囊對(duì)AD大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)變化的影響 空白組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞層數(shù)較多，排列緊密整齊，染色均勻，核仁深染，形態(tài)完整；模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)明顯改變，層數(shù)減少，排列松散不均勻，核仁固縮伴有明顯破裂，死亡神經(jīng)細(xì)胞多見；黃蒲通竅膠囊組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞分布相對(duì)均勻，排列較為緊密。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(HE染色，10×40倍)

3.3 黃蒲通竅膠囊對(duì)AD大鼠海馬Wnt5、Frizzled和PLCβ蛋白表達(dá)水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠海馬Wnt5、Frizzled、PLCβ蛋白表達(dá)水平均明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，黃蒲通竅膠囊組大鼠海馬Wnt5、Frizzled、PLCβ蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬Wnt5、Frizzled、PLCβ蛋白表達(dá)水平比較

3.4 黃蒲通竅膠囊對(duì)AD大鼠含藥血清中IP3表達(dá)水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中IP3表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，黃蒲通竅膠囊組大鼠血清中IP3的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見圖5。

注：A.空白組；B.模型組；C.黃蒲通竅膠囊組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)通過迫使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳，并學(xué)會(huì)尋找隱藏在水中的平臺(tái)，被廣泛用于評(píng)估動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力。通過各組大鼠的逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)和第三象限路程及時(shí)間百分比實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：與空白組比較，模型組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力顯著下降；與模型組比較，黃蒲通竅膠囊組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力顯著改善。由HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：與空白組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞萎縮破裂、層數(shù)減少、排列松散；與模型組比較，黃蒲通竅膠囊組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠Wnt5、Frizzled、PLCβ蛋白表達(dá)水平均明顯升高；與模型組比較，黃蒲通竅膠囊組大鼠Wnt5、Frizzled、PLCβ蛋白表達(dá)水平均明顯降低。ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠IP3表達(dá)水平明顯升高；與模型組比較，黃蒲通竅膠囊組IP3表達(dá)水平明顯降低。

AD作為一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病，其特征是吞咽、行走能力和注意力、記憶力等認(rèn)知功能的進(jìn)行性喪失。隨著國(guó)內(nèi)和世界人口的持續(xù)老齡化，AD所帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)將逐年加重。盡管廣大研究者為此已作出很多努力，但仍無法治愈AD[11]。

中醫(yī)將AD歸為“呆病”“善忘”范疇，其發(fā)病的主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，腎精虧虛是早期癡呆發(fā)生的基礎(chǔ)，腎精虧虛，腦髓失充，元神失養(yǎng)，則頭暈耳鳴，記憶力減退，思維遲鈍[12]。AD的證型有腎虛髓虧、肝腎陰虛、痰蒙清竅、瘀阻清竅、心肝火旺、心脾兩虛、氣虛血瘀等[13]。黃蒲通竅膠囊中大黃消積化滯、逐瘀通經(jīng)，石菖蒲開竅豁痰、醒神益智，人參大補(bǔ)元?dú)?、安神益智，益智仁暖腎溫脾、益氣健腦，川芎活血化瘀、行氣止痛，制何首烏滋補(bǔ)腎陰、補(bǔ)益精血。諸藥合用，益氣補(bǔ)腎、豁痰化瘀，扶正與驅(qū)邪兼顧，符合中醫(yī)治療AD的基本原則。

Wnt蛋白是一類分泌型的糖蛋白。Wnt基因編碼的分泌型糖脂蛋白包括Wnt1、Wnt3a、Wnt5a及Wnt11等[14]。Wnt蛋白通過與受體Frizzled結(jié)合誘導(dǎo)經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路和非經(jīng)典的Wnt/Ca2+通路[15]。Wnt信號(hào)通路控制多種生物過程。研究[16]顯示，Wnt/Ca2+與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。在Wnt/Ca2+信號(hào)通路中，Wnt5可以與細(xì)胞表面的跨膜蛋白Frizzled結(jié)合刺激異源三聚體G蛋白，可進(jìn)一步激活PLC，進(jìn)一步增加IP3的水平[17-18]。IP3促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放，促使細(xì)胞膜上鈣通道打開，Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，高水平的鈣通過激活蛋白激酶C和磷酸酶鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶等鈣依賴性蛋白，調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)，防止Aβ寡聚體誘導(dǎo)的線粒體斷裂，調(diào)控抗凋亡線粒體蛋白Bcl-2的表達(dá)[17，19]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠調(diào)控線粒體外膜通透性，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[20]。課題組前期研究[21]顯示，黃蒲通竅膠囊能夠增加AD大鼠模型海馬Bcl-2的表達(dá)，抑制線粒體凋亡。另外課題組研究[8]顯示，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，導(dǎo)致CaM-CaMKⅣ信號(hào)通路激活，進(jìn)一步導(dǎo)致Tau蛋白過度磷酸化。因此，筆者推測(cè)黃蒲通竅膠囊對(duì)AD模型大鼠的作用機(jī)制可能與抑制Wnt/Ca2+信通路，減少Ca2+超載，抑制CaM/CaMKⅣ信號(hào)通路，最終抑制Tau蛋白的過度磷酸化有關(guān)。