騫秀芳，羿鳳云，孫會(huì)仙

慢性骨髓炎(chronic osteomyelitis, COL)是由細(xì)菌感染引起的骨膜、骨質(zhì)和骨髓的炎性反應(yīng)性疾病，具有病因復(fù)雜、病程漫長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，臨床多采用抗菌藥物預(yù)防性應(yīng)用控制感染。但長(zhǎng)期或不規(guī)范應(yīng)用抗菌藥物易致耐藥菌種增多，給COL的臨床診治增加了難度。抗骨髓炎片是由金銀花、蒲公英等6味藥組成的中成藥，具有扶正護(hù)陰、清熱解毒、生肌排膿之效，臨床多用于骨髓炎、骨膜炎、附骨疽等疾病治療，療效確切。目前，將中藥與抗菌藥物合用，在抗感染和多重耐藥菌方面發(fā)揮協(xié)同或相加作用，成為臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本研究通過(guò)COL家兔模型，觀察抗骨髓炎片對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨感染的預(yù)防作用及機(jī)制，為其臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性新西蘭白兔50只，體重(2.5 ± 0.5)kg，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。單籠適應(yīng)性飼喂1周。所有動(dòng)物相關(guān)操作規(guī)程均經(jīng)武警北京總隊(duì)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 試藥和儀器 抗骨髓炎片(萊陽(yáng)市江波制藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品)，以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制成濃度9.6%、4.8%的溶液，作為高、低劑量；鹽酸克林霉素膠囊(由康普藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品)，以0.5% CMC-Na配制成濃度1.2%的溶液；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC6538P標(biāo)準(zhǔn)型)，由武警北京總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科提供；魚肝油酸鈉注射液(上海信誼金朱藥業(yè)有限公司產(chǎn)品)；降鈣素原(PCT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-1β(IL-1β)、IL-4、IL-6、IL-10等酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供；采用光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司產(chǎn)品)；血細(xì)胞分析儀(日本希森美康株式會(huì)社產(chǎn)品)；X線機(jī)(日本東芝公司產(chǎn)品)；酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司產(chǎn)品)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 方法

1.3.1 制備COL動(dòng)物模型 參照文獻(xiàn)[4]方法行脛骨平臺(tái)手術(shù)。將新西蘭白兔麻醉，仰位固定，于右脛骨近端處備皮并消毒，在近端外側(cè)縱行剪開(切口長(zhǎng)2 cm)，分離肌肉，顯露出脛骨平臺(tái)(干骺端)，用克氏針在干骺端鉆孔以打通骨髓腔，繼而向骨髓腔內(nèi)注射5%魚肝油酸鈉0.1 ml，并將浸有Staphylococcus aureus菌液(1×10CFU/ml)0.5 ml的膠原蛋白海綿球塞進(jìn)鉆孔處。術(shù)后止血，以骨蠟封閉鉆孔，縫合切口并消毒。另取新西蘭白兔，除將Staphylococcus aureus菌液替換成生理鹽水外，其他手術(shù)操作同上，作為假手術(shù)組。手術(shù)2周后，所有模型兔對(duì)右脛骨行X線檢查，均呈現(xiàn)骨感染征象；并提取術(shù)區(qū)表面分泌物行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)，證實(shí)Staphylococcus aureus感染，說(shuō)明模型制備成功。

1.3.2 分組和治療 模型制備后將試驗(yàn)兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為：假手術(shù)組(0.5% CMC-Na)、模型組(0.5% CMC-Na)、抗骨髓炎片低劑量組(240 mg/kg)、抗骨髓炎片高劑量組(480 mg/kg)、克林霉素組(克林霉素60 mg/kg)，每組10只。術(shù)后第2天各組開始灌胃給藥(5 ml/kg)，持續(xù)6周，假手術(shù)組和模型組給予等體積溶媒。

1.3.3 X線片診斷分級(jí) 各組分別于給藥后第2、4、6周麻醉，將所有試驗(yàn)兔的右脛骨行X線片，參照文獻(xiàn)[6]方法對(duì)X線片進(jìn)行診斷分級(jí)：(1)輕度，有局灶性骨質(zhì)破壞或缺損區(qū)，周圍密度高，小范圍的骨膜增生，骨紋理趨于規(guī)則；(2)中度，病變區(qū)顯著增生，骨質(zhì)密度增高，髓腔狹窄或消失，骨紋理不規(guī)則；(3)重度，病變區(qū)廣泛，可見軟組織包塊影，骨膜增生，骨質(zhì)顯著破壞，有多處透亮區(qū)，死骨呈大片狀或不規(guī)則游離。

1.3.4 紅細(xì)胞沉降率(ESR)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)測(cè)定 分別于給藥后第2、4、6周，各組試驗(yàn)兔禁食不禁水12 h，自耳緣靜脈采血，取其中1 ml采用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)ESR和WBC。

1.3.5 血清因子檢測(cè) 取上述耳緣靜脈血2 ml，離心分出血清，ELISA法上酶標(biāo)儀測(cè)定感染性指標(biāo)PCT、CRP水平及促炎/抗炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10)水平，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 抗骨髓炎片對(duì)COL家兔脛骨診斷分級(jí)的影響 假手術(shù)組基本正常，未納入診斷分級(jí)。模型組家兔脛骨處發(fā)紅、腫脹明顯，部分存在破潰成竇道并有白色膿流出等現(xiàn)象(圖1)，X線片診斷分級(jí)以重度為主。各給藥組家兔脛骨處發(fā)紅、腫脹較輕，部分未見竇道，部分竇道較快愈合；抗骨髓炎片高劑量組X線片診斷分級(jí)以輕、中度為主，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；抗骨髓炎片低劑量組X線片診斷分級(jí)在給藥后第4、6周與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01，表1)。

圖1 各組家兔脛骨情況A.模型組；B.高劑量組；C.低劑量組；D.克林霉素組

表1 抗骨髓炎片對(duì)COL家兔脛骨診斷分級(jí)的影響

2.2 抗骨髓炎片對(duì)COL家兔炎性指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物ESR、WBC、PCT和CRP在給藥后第2、4、6周均有明顯升高(<0.01)；抗骨髓炎片高、低劑量組和克林霉素組ESR、WBC、PCT和CRP在給藥后第2、4、6周均有顯著降低，與同一時(shí)間點(diǎn)模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，表2)。

表2 抗骨髓炎片對(duì)COL家兔炎性指標(biāo)的影響

2.3 抗骨髓炎片對(duì)COL家兔血清細(xì)胞因子的影響 與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物血清IL-1β和IL-6含量在給藥后第2、4、6周均明顯升高，IL-4和IL-10含量分別在給藥后第2、4、6周和給藥后第4、6周明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；與模型組相比，抗骨髓炎片高、低劑量組IL-1β和IL-6含量在給藥后第2、4、6周均顯著降低，IL-4和IL-10含量在給藥后第6周顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，表3)；克林霉素組對(duì)血清IL-4和IL-10含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 抗骨髓炎片對(duì)COL家兔血清細(xì)胞因子含量的影響

3 討 論

控制感染、促進(jìn)骨修復(fù)是臨床骨感染的研究重點(diǎn)，只有控制感染，才能為進(jìn)一步修復(fù)骨組織缺損創(chuàng)造條件；臨床上針對(duì)COL采取的長(zhǎng)期或不規(guī)范應(yīng)用抗菌藥物的治療方式，易致耐藥菌的產(chǎn)生，進(jìn)而使感染愈加難以控制。COL屬中醫(yī)學(xué)“附骨疽”范疇，中醫(yī)認(rèn)為“附骨疽”多因機(jī)體感受外來(lái)傷害之毒邪或患病后余毒未清，邪毒蘊(yùn)結(jié)于筋骨，壅盛之濕熱阻塞經(jīng)絡(luò)，毒聚血凝，日久而??；治法當(dāng)清熱解毒、活血生肌、行瘀通絡(luò)、調(diào)補(bǔ)氣血等。本研究采用的抗骨髓炎片成分(金銀花、白頭翁、地丁、半枝蓮、蒲公英、白花蛇舌草)皆為苦寒之品，共奏清熱解毒、散瘀消腫之功；現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，抗骨髓炎片各成分對(duì)多種病原微生物特別是Staphylococcus aureus有明顯的殺滅或抑制作用。本研究采用COL急性感染階段開始給藥的方式觀察抗骨髓炎片的療效，X線片診斷分級(jí)結(jié)果表明抗骨髓炎片可顯著減輕家兔脛骨感染的嚴(yán)重程度，提示該藥可能通過(guò)改善機(jī)體整體狀況、調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境等途徑，以促進(jìn)骨修復(fù)。

血液學(xué)參數(shù)ESR和WBC活性常用于評(píng)估機(jī)體炎性反應(yīng)程度，血清炎性標(biāo)記物PCT和CRP是骨與關(guān)節(jié)感染性疾病病情進(jìn)展和臨床療效的判斷依據(jù)。本研究中假手術(shù)組ESR和WBC水平極低，而模型組WBC在各時(shí)間段均保持在較高水平，隨時(shí)間推移模型組ESR有一定降低，但與假手術(shù)組差異明顯，說(shuō)明COL家兔發(fā)生了嚴(yán)重的炎性反應(yīng)；模型組血清PCT和CRP水平隨時(shí)間推移有回落趨勢(shì)，符合COL從急性演變至慢性的表現(xiàn)；抗骨髓炎片在治療2、4、6周后可使ESR、WBC、PCT和CRP水平明顯降低，結(jié)合脛骨X線片診斷分級(jí)的結(jié)果，提示抗骨髓炎片可在一定程度上控制COL家兔的感染，減輕炎性反應(yīng)所伴隨的骨組織破壞，有利于骨組織的修復(fù)愈合。

促炎與抗炎細(xì)胞因子間的平衡在COL病理進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。IL-1β和IL-6作為被普遍認(rèn)可的炎性反應(yīng)細(xì)胞因子，當(dāng)組織受損時(shí)會(huì)導(dǎo)致炎性反應(yīng)，影響體內(nèi)骨吸收與骨形成的動(dòng)態(tài)平衡，加重骨組織的破壞?？寡准?xì)胞因子IL-4、IL-10則可抑制過(guò)度的炎性反應(yīng)，促進(jìn)骨組織修復(fù)，在骨感染進(jìn)程中發(fā)揮維持組織穩(wěn)態(tài)的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，COL患者血清中IL-6濃度明顯高于健康人群，且與骨質(zhì)破壞程度呈一定相關(guān)性；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可增強(qiáng)由Staphylococcus aureus所致骨感染動(dòng)物的細(xì)菌清除能力，原因可能與抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)上升相關(guān)。本研究中，模型組COL家兔血清促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6表達(dá)有明顯升高，抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10表達(dá)亦有不同程度的增多，這與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的研究結(jié)果類似，說(shuō)明促炎與抗炎細(xì)胞因子平衡參與了COL病理進(jìn)程；治療后不同時(shí)間段，抗骨髓炎片高、低劑量組均可顯著減少家兔血清IL-1β和IL-6表達(dá)，治療后6周可顯著增加血清IL-4和IL-10表達(dá)，提示抗骨髓炎片可能是糾正了細(xì)胞因子間的失衡狀態(tài)，改善了機(jī)體的免疫功能和整體狀況，進(jìn)而減輕骨組織的破壞程度，本研究結(jié)果也為該藥物在骨髓炎治療方面的臨床應(yīng)用提供了一定的參考價(jià)值；克林霉素對(duì)血清Th2型抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10含量則無(wú)明顯影響，提示抗骨髓炎片作用機(jī)制與克林霉素不同，鑒于淋巴細(xì)胞Th1/Th2亞群及其分泌的細(xì)胞因子在免疫功能中所起作用的重要性和復(fù)雜性，藥物對(duì)Th1/Th2亞群的影響尚需深入探討。

總之，抗骨髓炎片可能是通過(guò)恢復(fù)促炎與抗炎細(xì)胞因子平衡、減輕炎性反應(yīng)程度等途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)COL家兔骨感染的保護(hù)作用，其具體作用靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究。