王李潤,王立斯

(上海市松江區(qū)方塔中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，上海 201600)

再生障礙性貧血(AA)是由多種病因所致的全血細(xì)胞減少和骨髓造血功能衰竭的造血系統(tǒng)疾病，該病為兒童時期最嚴(yán)重的血液疾病之一[1]。AA發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但較多報道[2-3]顯示，AA患者機(jī)體存在T細(xì)胞亞群數(shù)量、活化狀態(tài)等免疫功能紊亂，從而損害骨髓造血組織，直接殺傷造血細(xì)胞，且在該過程中會釋放過量細(xì)胞因子抑制造血細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Th1、Th2細(xì)胞作為T淋巴細(xì)胞的主要亞群，Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥等多種自身免疫性疾病的主要機(jī)制[4-5]。報道顯示，超過的70%AA患者病因不詳，約10%患者為遺傳性[6]。AA的發(fā)病機(jī)制仍為目前研究的熱點。為此，本研究探討重型再生障礙性貧血(SAA)患兒外周血Th1/Th2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2019年1月～2020年10月在本院住院治療的96例AA患兒，入選標(biāo)準(zhǔn)：符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)(第3版)》中小兒AA診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；血紅蛋白(Hb)<100 g/L，血小板計數(shù)(PLT)<50×109/L，中性粒細(xì)胞絕對值<1.5×109/L；骨髓穿刺檢測提示骨髓增生減低，非造血細(xì)胞占比增高；患兒家屬對本研究內(nèi)容知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：入組前3個月內(nèi)接受過抗炎、免疫抑制劑等藥物治療；合并嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎功能障礙、感染及其他血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾??；合并惡性腫瘤、重要器官衰竭。本次研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，共納入96例，男51例，女45例，年齡2～14歲，平均(7.59±1.43)歲，按Camitta分型標(biāo)準(zhǔn)[8]：輕型再生障礙性貧血(MAA)55例，SAA 41例；其中，37例療效較好，59例療效較差；另選取我院體檢科健康自愿兒童50例為對照組，男27例，女23例，年齡2～13歲，平均(7.56±1.41)歲。兩組性別(χ2=0.091，P=0.541)、年齡(t=0.171，P=0.340)等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2AA療效標(biāo)準(zhǔn)[7]：有效：貧血、出血等癥狀明顯緩解，Hb水平增長>30 g/L，且3個月內(nèi)未見療效較差反彈；欠佳或無效：臨床癥狀、實驗室指標(biāo)未見緩解甚至出現(xiàn)惡化。

1.3方法：外周血Th1/Th2測定：①主要試劑：淋巴細(xì)胞分離試劑盒購自美國GENMED公司；抗人CD4 FITC、抗人IFN-γ FITC、抗人IL-4 FITC均購自美國CST 公司；二抗均購自美天旎生物科技公司；②檢測方法：采集受試者清晨空腹肘靜脈血5 ml，肝素鈉抗凝，取200 μl全血采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單核淋巴細(xì)胞，采用BD FACScalibur流式細(xì)胞儀測定Th1細(xì)胞(CD4+IFN-γ+)和Th2細(xì)胞(CD4+IL-4+)，并計算Th1/Th2值；③外周血細(xì)胞因子測定：取上述血液3 ml，2 000 r/min離心10 min后取血清層，采用酶聯(lián)免疫法測定血清中干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)濃度，檢測試劑盒均購自美國R&D公司，在酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司，3550UV型)450 nm處測定吸光度值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)指標(biāo)的濃度。

2 結(jié)果

2.1外周血Th1/Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子比較：AA組外周血Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-2均明顯高于對照組，而Th2、IL-4、IL-6均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SAA組外周血Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-2均高于MAA組，而Th2、IL-4、IL-6均低于MAA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組受試者外周血Th1/Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子表達(dá)情況

2.2不同臨床療效Th1/Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子比較：療效好組、療效較差組年齡、性別資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，療效較差組外周血Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-2均明顯高于療效好組，而Th2、IL-4、IL-6均明顯低于療效好組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床療效Th1/Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子比較

2.3Th1/Th2細(xì)胞因子診斷SAA效能：外周血IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6診斷SAA的ROC曲線結(jié)果顯示，IL-2敏感度最高(76.92%)，其次為IL-4(70.53%)，IL-6(57.00%)最低；IL-4特異度(41.29 %)最高，其次為IL-2(30.00%)、IL-6(26.00%)，IFN-γ的敏感度和特異度均為最低；四者聯(lián)合檢測診斷SAA的診斷曲線下面積(AUC)為0.932，敏感度(86.15%)、特異度(61.28%)均顯著提高。見表3。

表3 Th1/Th2細(xì)胞因子診斷SAA的效能分析

3 討論

AA是一種骨髓造血干細(xì)胞缺乏所致的全血細(xì)胞減少的骨髓衰竭性疾病，以貧血、出血和感染為臨床表現(xiàn)，如不予以積極治療，重型AA的病死率高達(dá)75%[1，9]。目前，多數(shù)研究認(rèn)為，AA是淋巴細(xì)胞功能紊亂所致的自身免疫性疾病，生理狀態(tài)下T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量相對穩(wěn)定，且呈動態(tài)平衡，在病因刺激下可導(dǎo)致細(xì)胞亞群數(shù)量改變，最終導(dǎo)致造血功能障礙[10-11]。臨床研究證實，SAA發(fā)病期外周血Th1/Th2細(xì)胞平衡發(fā)生偏移，Th1細(xì)胞數(shù)量增多，其細(xì)胞功能亢進(jìn)，Th1/Th2值增大[12]。提示通過測定外周血Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可能對診斷和治療AA具有重要價值。

Th1和Th2細(xì)胞均由CD4+T淋巴細(xì)胞激活后分化產(chǎn)生， Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)局部炎性反應(yīng)和細(xì)胞免疫過程；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6等細(xì)胞因子，可通過刺激B淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)IgE、IgG等抗體產(chǎn)生，主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)過程[13]。生理狀態(tài)下Th1和Th2細(xì)胞數(shù)量及其細(xì)胞功能處于相對穩(wěn)定而平衡狀態(tài)，共同維持機(jī)體正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能穩(wěn)定。研究表明，AA患者的免疫異常主要表現(xiàn)為CD4+T淋巴細(xì)胞亞群紊亂、Th1細(xì)胞數(shù)量異常增加及其細(xì)胞功能亢進(jìn)，產(chǎn)生Th1細(xì)胞漂移[14]。為此，本研究通過流式細(xì)胞術(shù)法測定受試者外周血Th1和Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，AA組外周血Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-2均明顯高于對照組，而Th2、IL-4、IL-6均明顯低于對照組，表明AA患兒機(jī)體存在Th1細(xì)胞數(shù)量增多，Th1細(xì)胞分泌功能增強(qiáng)，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果[15]一致。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，SAA組外周血Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-2均高于MAA組，而Th2、IL-4、IL-6均低于MAA組，表明SAA患兒Th1細(xì)胞亢進(jìn)程度加重，通過檢測Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子對病情判斷具有一定的參考價值。本研究分析：Th1細(xì)胞占比增高與其分泌的細(xì)胞因子參與AA的疾病進(jìn)展，CD4+T淋巴細(xì)胞受絲裂原激活后傾向于分化成Th1細(xì)胞，必然導(dǎo)致向Th2細(xì)胞分化減少，會導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫亢進(jìn)，加重自身免疫病情；同時，IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子對Th1細(xì)胞敏感，可誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞增多，而抑制向Th2細(xì)胞的分化過程，甚至將Th2向Th1逆轉(zhuǎn)，形成惡性閉環(huán)。而IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子具有阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入休眠期及增強(qiáng)細(xì)胞凋亡等作用，可促進(jìn)造血細(xì)胞凋亡，并抑制造血干、祖細(xì)胞增殖過程，最終導(dǎo)致造血功能減退。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，療效較差組外周血Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-2均明顯高于療效好組，而Th2、IL-4、IL-6均明顯低于療效好組，提示監(jiān)測Th1/Th2細(xì)胞平衡調(diào)節(jié)對SAA的臨床治療具有一定的指導(dǎo)意義。另外，本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，Th1、Th2細(xì)胞分泌的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6診斷SAA的敏感度和特異度均較低，而四者聯(lián)合檢測診斷SAA的診斷AUC為0.932，敏感度與特異度分別為86.15%、61.28%，較各指標(biāo)單純應(yīng)用診斷效能明顯提升，對SAA的早期診斷具有較高的參考價值。

綜上所述，SAA患兒機(jī)體存在Th1/Th2細(xì)胞平衡向Th1細(xì)胞偏移，IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子分泌增加，監(jiān)測Th1/Th2平衡變化對AA病情、臨床治療及早期診斷均具有較高的參考價值。