蔡 蕊，卓澤勇，陳 明

(東莞市東部中心醫(yī)院新生兒科，廣東 東莞 523000)

支氣管肺發(fā)育不良(BPD)是臨床早產(chǎn)兒常見的一種慢性肺部疾病，隨著臨床醫(yī)學和新生兒ICU技術(shù)的不斷更新，顯著提升了早產(chǎn)兒存活率，特別是極低出生體質(zhì)量兒以及極早早產(chǎn)兒[1]。早產(chǎn)兒目前在國內(nèi)有較高的發(fā)生率，占比9.9%左右，居世界第二位[2]。早產(chǎn)兒BPD發(fā)生率也隨之增長，胎齡在28周以下的早產(chǎn)兒BPD發(fā)生率在40%左右[3]。患兒發(fā)病初期需長時間住院，隨著發(fā)病時間的延長，會由于發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病再入院治療，再入院大部分患兒會合并神經(jīng)系統(tǒng)損害，不僅會在一定程度上影響生長發(fā)育，同時還會降低生活質(zhì)量。及早預測高風險的BPD早產(chǎn)兒對預后改善十分關(guān)鍵。然而現(xiàn)階段臨床中針對此種疾病尚未有預測方案。多項臨床研究顯示，多種臟器纖維化中，Smads信號轉(zhuǎn)導通路起到顯著作用，此通路形成過程中骨形成蛋白-7(BMP-7)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是不可或缺因子，均參與了肺損傷[4]。還有臨床小鼠研究提示，在高體積分數(shù)氧誘導小鼠BPD組織內(nèi)，lncRNA AK096792水平較高，而小鼠和人體均存有l(wèi)ncRNA[5]。該指標在血液中穩(wěn)定性較高，可抑制核酸核酶降解，能夠作為早產(chǎn)兒BPD的診斷標志物。因此選擇了本院新生兒ICU收治的74例早產(chǎn)兒為研究對象，針對lncRNA AK09679聯(lián)合BMP-7與TGF-β1用于預測早產(chǎn)兒BPD的臨床價值進行了研究。

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇2018年6月～2020年8月本院新生兒ICU收治的74例早產(chǎn)兒為研究對象，按照早產(chǎn)兒BPD診斷標準分成44例的非BPD組和30例BPD組。入組標準：所有患兒全部與相應診斷標準相符，即美國國立衛(wèi)生研究院聯(lián)合 BPD 研究小組2000年6月發(fā)布的標準[6]，氧氣依賴超過28 d(超過210 ml/L)新生兒；胎兒胎齡28～32周(不含32周)，出生體重在1 500 g以下；出生后24 h內(nèi)轉(zhuǎn)入新生兒ICU。排除標準：先天性疾病患兒；存活時間不超過28 d患兒。患兒家屬均同意本次研究，且獲得院內(nèi)倫理委員會批準。非BPD組男22例，女22例；胎齡28～31周，平均(29.31±0.74)周；出生體重1 334～1 450 g，平均(1 381.36±107.11)g；剖宮產(chǎn)32例，自然分娩12例。非BPD組患兒男16例，女14例；胎齡29～31周，平均(30.1±0.59)周；出生體重1 334～1 450 g，平均(1 381.36±107.11)g；剖宮產(chǎn)18例，自然分娩12例。兩組一般資料對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法：在患兒出生第1天、第7天、第14天采集患者1 ml動脈血，置入肝素抗凝管內(nèi)儲存，標本采集30 min后在4 ℃環(huán)境下以2 000 r/min的速度離心處理15 min，將上層血漿取出后儲存于-80 ℃冰箱內(nèi)。選擇酶聯(lián)免疫吸附法按照相應試劑盒說明對血漿BMP-7、TGF-β1水平進行檢測?；純撼錾鷷r采集2～5 ml，放于血清分離管，以3 000 r/min的速度離心處理15 min，之后儲存于-70℃冰箱內(nèi)。將血清取出后置入Trizol，振蕩后在室內(nèi)溫度下放置10 min，根據(jù)相應試劑盒要求提取RNA和開展qPCR反應，10 μl為反應體系，置入384孔板內(nèi)進行。反應條件：預變性(95 ℃)2 min，變性(95 ℃)15 s，退火(56 ℃)15 s，延伸(72 ℃)1 min，循環(huán)40，溶解曲線分析。在各個樣品中，設(shè)置重復對照孔三個。通過Genbank 數(shù)據(jù)庫查詢引物全長序列，其中AK096792下游引物CCTCCTTCTGCTCCTCTCAG，上游引物CCAGTCCGCTTCGCTATCTA；親環(huán)蛋白A基因下游引物TCGAGTTGTCCACAGTCAGC，上游引物TTCATCTGCACTGCCAAGAC。

1.3觀察指標：記錄患兒出生第1天、第7天、第14天血漿BMP-7、TGF-β1水平以及臍帶血中l(wèi)ncRNA AK096792表達水平。

2 結(jié)果

2.1不同時間患兒血漿TGF-β1水平比較：與非BPD組相比，BPD組出生第1天、第7天、第14天的血漿TGF-β1水平均較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間血漿TGF-β1水平對比

2.2不同研究患兒血漿BMP-7水平對比：與非BPD組相比，BPD組出生第1、7、14d的血漿BMP-7均較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同時間患兒血漿BMP-7水平對比

2.3不同時間患兒臍帶血lncRNA AK096792表達水平對比：與非BPD組臍帶血lncRNA AK096792表達水平[(104.25±20.49)%]相比，BPD組[(486.39±279.63)%]均更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

早產(chǎn)兒常見嚴重疾病之一為BPD，主要以肺組織纖維化和受損后異常修復、肺微血管和肺泡發(fā)育異常、肺發(fā)育不成熟等為臨床特征，而纖維化占比較高，而誘發(fā)該疾病的主要因素為遺傳、炎性反應、感染、氧化應激反應、機械通氣損傷等[7-8]。

現(xiàn)階段引起纖維化最重要的細胞因子之一為TGF-β1。相關(guān)臨床研究顯示，急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病過程中，早產(chǎn)兒在出生第3天時，TGF-β1水平會升至峰值，并在第7天時逐漸恢復至正常水平，這就說明該細胞因子在早期肺損傷過程中起到一定作用[9]。部分研究顯示，早產(chǎn)兒發(fā)生BPD后，其TGF-β1水平在早期肺泡灌洗液中顯著提升，且和BPD呈相關(guān)[10]。還有臨床研究提示，在TGF-β1在正常新生鼠肺組織中水平顯著低于BPD模型新生鼠，顯示此種細胞因子會對BPD起促進作用[11]。本研究結(jié)果中，和非BPD組血漿TGF-β1水平相比，在出生第1天、第7天、第14天的BPD組水平均較高。雖然在第7天出現(xiàn)下降情況，但是之后又出現(xiàn)了上升情況。出現(xiàn)肺損傷后，肺組織細胞膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體會與TGF-β1相結(jié)合，加強磷酸化Smad2/3，并和Smad4產(chǎn)生作用，以生成活性高的轉(zhuǎn)錄復合物，進入細胞核內(nèi)對相應基因轉(zhuǎn)錄情況進行有效調(diào)節(jié)。

在TGF超家族中，最大蛋白家族為BMP，在肺過敏性炎性反應中，BMP-7起顯著作用。相關(guān)小鼠研究顯示，BMP-7水平下降可加重肝纖維化，說明BMP-7具有抗纖維化功能[12]。絲氨酸/蘇氨酸激酶受體之一為BMP-7受體，提高Smad 6、7以控制Smads蛋白水平，進而阻止Smad2/3磷酸化，產(chǎn)生Smad 4以阻礙TGF-β1轉(zhuǎn)導信號。多項研究提示，臟器纖維化中BMP-7水平會顯著降低[13]。本研究結(jié)果說明BPD有BPM-7參與，出生7天后會升至峰值，能夠有效預測BPD的發(fā)生。早產(chǎn)兒早期出現(xiàn)肺損傷后，保護因子包括BMP-7，其水平升高會對機體起到保護作用，并與Smad4競爭性結(jié)合，調(diào)節(jié)TGF-β1，并抑制其水平提高。因此BPD患兒在出生第7天時，BMP-7高于第1天，TGF-β1下降。而肺損傷的加重且BMP-7無法調(diào)節(jié)時，TGF-β1會提升，對受損肺組織起修復作用，此外還會阻止BMP-7表達，因此BPD患兒出生第14天會出現(xiàn)BMP-7下降、TGF-β1上升，最終產(chǎn)生BPD。這一結(jié)果與本研究結(jié)果較相似。

早產(chǎn)兒BPD至今仍未明確發(fā)病機制，然而多項臨床研究證實，肺發(fā)育中l(wèi)ncRNA起到顯著作用[14]。CDC6基因可通過lncRNA_MALAT1起到抗凋亡作用，抗肺泡上皮細胞死亡，抵抗BPD發(fā)病。多條lncRNA可通過Foxa2、Gata6對NKx2.1、視黃酸、Wnt進行調(diào)控，進而影響肺部發(fā)育。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，可通過BPD和lncRNA AK096792的聯(lián)系預測BPD的發(fā)生[15]。本次研究結(jié)果。說明BPD發(fā)病中l(wèi)ncRNA AK096792可能參與其中，還可能和BPD嚴重程度密切相關(guān)。

綜上所述，lncRNA AK09679、血漿骨形成蛋白-7與轉(zhuǎn)化生長因子-β1與早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生密切相關(guān)，對預測早產(chǎn)兒BPD臨床價較高。