李志樂，韋秋宇，言 緯，劉 燕，韋寶敏，黃照河

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院心血管內科，廣西 百色 533000)

動脈粥樣硬化(As)是心血管疾病的始動環(huán)節(jié)與病理基礎，炎性反應參與其發(fā)生發(fā)展的過程[1]。既往研究表明，白細胞介素(IL)-1β、γ-干擾素(IFN-γ)均是促As的炎性因子[2-3]，IL-10可通過抗炎及調控線粒體自噬而抗As[4]。B7-H3、B7-H4是近年新發(fā)現的B7家族成員，作為負性協同刺激因子能抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞的活化與增殖而抑制IL-1β、IFN-γ等細胞因子的表達，從而減輕炎性反應[5-6]。煙酸作為調脂藥物，可通過激動其受體GPR109A發(fā)揮全面而獨特的調脂和升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)最有效的作用外[7]，還可增加血管內皮細胞氧化還原狀態(tài)，抑制參與As的氧化應激和細胞因子的產生，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化、改善血管內皮功能等多種效應作用[8]，但是煙酸對As炎性反應的影響及機制尚未見相關報道。本研究擬構建兔As模型后予煙酸干預，探討煙酸抗As炎性反應的可能機制，為臨床上煙酸治療As提供理論依據。

1 資料與方法

1.1實驗動物：選取30只清潔級成年健康雄性新西蘭大白兔作為實驗動物，年齡3個月，體重2.0～2.5 kg。實驗動物許可證號為SCXK桂2012-0003，購自右江民族醫(yī)學院實驗動物中心。本次研究經過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2材料和儀器：煙酸購自北京嘉康源公司，膽固醇購自安徽天啟化工公司，蛋黃粉購自毫州市紅日實業(yè)有限公司，全自動生化分析儀生化試劑購自濟南卓隆生物科技有限公司，血清炎性細胞因子的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司，Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自上海睿時生物科技有限公司，Real Master Mix試劑盒購自北京TIANGEN公司。7170型全自動生化分析儀購自日本日立公司，ABI 7500實時熒光定量PCR儀(RT-PCR)購自美國應用生物系統(tǒng)公司，DMR+550型病理圖像分析儀購自德國Leica公司。

1.3分組及處理方法：將30只成年健康雄性新西蘭大白兔隨機數字表法均分為3組，分別為對照組、As組和煙酸組。首先制作高脂飲食，即由3.0%膽固醇、8.5%蛋黃粉、8.5%豬油和80%普通動物飼料制成；其次構建實驗性As模型，即As組持續(xù)予高脂飲食14周，煙酸組在高脂飲食8周基礎上加予煙酸200 mg/(kg·d)干預治療6周，對照組予普通飲食14周。實驗前、實驗后0周、8周及14周采集外周兔耳靜脈血，實驗結束時選取靠近主動脈弓部的主動脈約1.5 cm，行主動脈病理檢測，剩余置于液氮中備行RT-PCR檢測。

1.3.1血脂水平檢測：在實驗前、實驗后0周、8周及14周末分別空腹采集3組兔耳外周靜脈血2 ml，靜置30 min后進行3 000 r/min離心15 min分離出血清，采用7170型全自動生化分析儀檢測血清各組血脂水平，包括血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及HDL-C。

1.3.2主動脈HE染色法檢測：取兔主動脈弓起始處至胸主動脈段，生理鹽水沖洗并分離主動脈，剪取同一部位0.5～1.0 cm長血管段，置于10%緩沖甲醛液固定24 h，石蠟包埋。血管橫斷面連續(xù)切片，厚約5 μm，用作蘇木精-伊紅(HE)染色。DMR+550型病理圖像分析儀測定主動脈粥樣斑塊最大橫截面積/主動脈橫截面積和主動脈內膜厚度。

1.3.3血清炎性細胞因子及可溶性B7-H3(sB7-H3)、可溶性B7-H4(sB7-H4)水平的測定：實驗前、實驗后0周、8周及14周分別采集3組兔耳外周靜脈血2 ml，靜置30 min后進行3 000轉/min離心15 min，分離出血清，保存于-80 ℃冰箱。取出血清標本，按照ELISA試劑盒的說明書進行操作，測定3組兔血清IL-1β、IFN-γ、IL-10和sB7-H3、sB7-H4水平。

1.3.4實時熒光定量PCR檢測外周血單核細胞和主動脈B7-H3、B7-H4 mRNA的表達：實驗14周末，采用密度梯度離心法分離外周血單核細胞及取兔主動脈弓起始處至胸主動脈段。用Trizol法提取兔外周血單核細胞與主動脈組織總RNA，測定260 nm和280 nm處的吸光度比值及其完整性，逆轉錄合成cDNA，ABI 7500實時熒光定量PCR儀行RT-PCR。B7-H3上游引物5'-GTC GCA TAC GCG TGC TAG CG-3'，下游引物5'-GTA TGC TGC CAG AGT G TA TCA GCG G-3'，擴增目的片段長度138 bp；B7-H4上游引物5'-CGT GAG CGA ATG CGA GAT CAG ATG-3'，下游引物5'-GTC ACG GCT GTG ACG CAG ACG T-3'，擴增目的片段長度168 bp;GAPDH上游引物5'-CGA CTG TCG ACG CAG AGG AC-3'，下游引物5'-TCG TGC CGA CGC CAG TCG A-3'，擴增目的片段長度128 bp。根據得出的熒光信號到達設定的域值時所經過的循環(huán)數(Ct)值，計算B7-H3、B7-H4 mRNA的表達量=2-△△Ct。

2 結果

2.13組白兔血脂水平比較：0周時，3組血脂水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。8周時，As組和煙酸組兔血清TC、TG及LDL-C水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而As組和煙酸組之間血脂水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。14周時，煙酸組兔血清TC、TG及LDL-C水平均顯著低于As組，較其8周時分別下降42.23%、17.41%、48.93%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而HDL-C水平明顯高于As組，較其8周時升高26.99%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組兔0周、8周和14周血脂水平比較

2.2煙酸對兔主動脈粥樣斑塊的影響：HE染色結果顯示，對照組兔主動脈壁結構清晰，內膜、中膜及外膜組織結構正常，光滑完整。As組主動脈內膜明顯增生增厚，血管內膜下可見泡沫細胞與脂質沉積，形成粥樣脂質斑塊，局部鈣化，呈典型As的病理改變，成功構建兔As模型；與As組比較，煙酸組主動脈內膜下粥樣斑塊病變顯著減輕。3組主動脈內膜厚度與粥樣斑塊面積比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1及表2。

圖1 3組兔主動脈組織HE染色(×40)

表2 3組兔主動脈斑塊面積和內膜厚度比較

2.33組兔血清IL-1β、IFN-γ、IL-10與sB7-H3、sB7-H4水平比較：0周時，3組兔血清IL-1β、IFN-γ、IL-10與sB7-H3、sB7-H4水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。8周時，與對照組比較，As組和煙酸組兔血清IL-1β、IFN-γ水平明顯升高，而血清IL-10、sB7-H3及sB7-H4水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。14周時，與對照組比較，As組和煙酸組兔血清IL-1β、IFN-γ水平明顯升高，而血清IL-10、sB7-H3及sB7-H4水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與As組比較，煙酸組兔血清IL-1β、IFN-γ水平顯著降低，而血清IL-10、sB7-H3及sB7-H4水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義；煙酸組兔血清IL-1β、IFN-γ水平顯著低于同組8周，而血清IL-10、sB7-H3及sB7-H4水平明顯高于同組8周，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組兔血清IL-1β、IFN-γ、IL-10與sB7-H3、sB7-H4水平比較

2.43組兔外周血單核細胞和主動脈B7-H3、B7-H4 mRNA的表達：與對照組比較，As組兔外周血單核細胞和主動脈B7-H3、B7-H4 mRNA表達水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與As組比較，煙酸組兔外周血單核細胞和主動脈B7-H3、B7-H4 mRNA的表達水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組兔外周血單核細胞與主動脈B7-H3、B7-H4 mRNA的表達

2.5線性相關分析：采用Pearson相關分析3組兔血清炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-10與sB7-H3、sB7-H4之間的關系，結果顯示，血清sB7-H3與IL-1β、IFN-γ分別呈負相關(r=-0.554，r=-0.534，P<0.05)，與IL-10呈正相關(r=0.692，P<0.05)。血清sB7-H4與IL-1β、IFN-γ分別呈負相關(r=-0.485，r=-0.466，P<0.05)，與IL-10呈正相關(r=0.676，P<0.05)。

3 討論

目前認為As是一種以劇烈的免疫活動為特征的慢性炎性疾病，炎性反應在As的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。B7家族是免疫球蛋白超家族，B7-H3是新發(fā)現的B7家族成員，與慢性炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，在高血壓合并頸As患者中明顯表達[10]；B7-H4能抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞的增殖，減少炎性細胞因子的產生，進而負性調控T淋巴細胞的免疫應答[11]。目前，B7-H3、B7-H4的生物學效應機制仍有爭議，其炎性反性免疫調節(jié)機制在As的發(fā)生、發(fā)展中的作用還有待探索與研究。

IL-10作為抗As的炎性細胞因子，具有逆轉與穩(wěn)定As斑塊的作用[12]。研究發(fā)現，在人類抗原呈遞細胞中B7-H4的表達顯著增強是通過IL-10自分泌的方式刺激導致，IL-10上調B7-H4的表達[13]，且可通過促進B7-H3、B7-H4的表達而抑制免疫反應[14]。本研究結果顯示，在As進展過程中，IL-10可能通過促進B7-H3、B7-H4的表達介導抗As的炎性反應。IL-1β、IFN-γ均是介導體液免疫炎性反應促As的炎性因子[2-3]。動物實驗表明，B7-H3可抑制IL-1β、IFN-γ等炎性細胞因子的分泌與激活，而IL-1β、IFN-γ在B7-H4-/-小鼠中的表達明顯升高。臨床研究證明抑制IL-1β表達，可治療多種慢性炎癥性疾病，表明IL-1β可作為臨床上As抗炎治療的潛在靶點[15]。本研究結果發(fā)現，As組兔血清sB7-H3、sB7-H4的水平及外周血單核細胞和主動脈B7-H3、B7-H4 mRNA的表達水平較對照組均明顯下降，而IL-1β、IFN-γ水平上調，兩者呈明顯的負相關。由此推測負性協同刺激因子B7-H3、B7-H4可能通過介導下調IL-1β、IFN-γ的表達來抗As的炎性反應，發(fā)揮中樞負性調節(jié)機制。

目前，對于As的防治主要以降脂、抗血小板聚集等方法，以他汀類、煙酸類為代表藥物。臨床研究表明，強化劑量阿托伐他汀可通過促進B7-H3、B7-H4表達，從而降低不穩(wěn)定型心絞痛患者支架植入術后的炎性免疫反應[16]。而煙酸具有全面而獨特的調脂和升高HDL-C最有效的作用外，可增加血管內皮細胞氧化還原狀態(tài)，抑制參與As的氧化應激和炎性細胞因子，具有抗炎、抗氧化、改善血管內皮功能等多種效應作用[8]，尤其是與他汀類聯合用藥后可顯著改善As[17]。本研究結果也證實煙酸具有獨特的降脂且升高HDL-C效果，可有效緩解As斑塊的病理進程，減少As斑塊面積。進一步研究發(fā)現，煙酸組兔血清IL-10、sB7-H3、sB7-H4含量及外周血單核細胞和主動脈B7-H3、B7-H4 mRNA的表達水平均顯著高于As組，而血清IL-1β、IFN-γ水平均明顯下調，提示煙酸可能通過促進B7-H3、B7-H4表達及刺激IL-10分泌而下調IL-1β、IFN-γ水平。Li等[18]研究發(fā)現煙酸抗炎功能是通過上調NAD-依賴性去乙?；负突钚匝醮兀瑥亩种芅LRP3炎性小體激活，干擾IL-1β的分泌來實現。結合本研究結果推測，煙酸可能是通過刺激IL-10分泌而介導B7-H3、B7-H4表達，從而抑制IL-1β、IFN-γ產生，從而實現抗As炎性反應。為此，煙酸抗As的炎性機制，可能與促進血液和主動脈B7-H3、B7-H4表達、降低As炎性反應有關，進而縮小主動脈斑塊厚度和面積，從而起到抗As作用。

綜上所述，煙酸可能通過促進協同刺激因子B7-H3、B7-H4表達，調節(jié)炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-10水平，從而抑制As炎性反應。如能進一步采用B7-H3、B7-H4特異性激動劑激活這一環(huán)節(jié)，抑制炎性因子的釋放，延緩As的進展，B7-H3、B7-H4亦有望成為As防治的新靶點。煙酸與他汀類藥物聯合應用，降脂與抗As療效更優(yōu)，可使As患者獲益更顯著。