HABIMANA，喬郅鈉，徐美娟，楊套偉，張顯，邵明龍，饒志明

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

高果糖漿(high fructose syrup，HFS)是一種功能性糖類水溶液，用作蔗糖的替代品，是生產(chǎn)營養(yǎng)性飲料和食品最常用的甜味劑之一[1-2]；還被認(rèn)為是生產(chǎn)5-羥甲基糠醛和乙酰丙酸的可再生資源，可用于合成其他有價值的生物石油化學(xué)產(chǎn)品，如塑料、綠色溶劑、潤滑劑和有價值的生物燃料[3-5]。與其他類型的糖相比，HFS還具備高甜度、高溶解度、低黏度、增強(qiáng)風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn)，是良好的保濕劑，且不會在酸性食品中引起任何副作用、不會形成晶體[6-8]。根據(jù)果糖含量不同，可將HFS分為HFS-42、HFS-55和HFS-90這3種類型[9]，但由于HFS-42型高果糖漿中果糖含量低，其醫(yī)療和保健價值不能得到充分發(fā)揮，且在低溫貯運(yùn)時易結(jié)晶析出[10]，因此，具有更高果糖濃度的HFS-55型高果糖漿成為主流產(chǎn)品。

HFS的生產(chǎn)方法有化學(xué)催化法和酶法?；瘜W(xué)催化法是葡萄糖在堿/酸性環(huán)境下異構(gòu)化成果糖，異構(gòu)化過程需在高溫條件下進(jìn)行，導(dǎo)致副產(chǎn)物多、選擇性低[11-12]。酶法已成為HFS工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法。TSUMURA等[13]發(fā)現(xiàn)嗜水假單胞菌中的木糖異構(gòu)酶可以將葡萄糖異構(gòu)化生成果糖。TSUMURA[14]和TAKASAKI等[15]先后發(fā)現(xiàn)了暗色產(chǎn)色鏈霉菌和白色鏈霉菌的葡萄糖異構(gòu)酶，可以將葡萄糖異構(gòu)化為果糖。已商業(yè)化的、用于HFS生產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶，一般在60 ℃左右催化，轉(zhuǎn)化率只能達(dá)到42%～45%，僅能用于HFS-42型高果糖漿的制備，要想獲得HFS-55型高果糖漿，還需進(jìn)行濃縮分離純化操作[16]。BHOSALE等[16]發(fā)現(xiàn)，溫度升高有利于葡萄糖異構(gòu)化生成果糖，可以獲得更高果糖濃度的HFS。因此，有很多研究通過篩選耐高溫的葡萄糖異構(gòu)酶，使其可以在在較高溫度下仍具有較高酶活力，以實現(xiàn)一步法合成HFS-55型高果糖漿[17-19]。雖然，一步法生物合成HFS-55已取得一定成效，但其宿主細(xì)胞大多是大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21，在催化過程中，E.coliBL21可能會將不符合食品衛(wèi)生要求的有害物質(zhì)帶入產(chǎn)品中，因此，實現(xiàn)葡萄糖異構(gòu)酶在研究背景清晰的食品安全菌株中的異源表達(dá)，以一步法安全合成HFS-55型高果糖漿是非常有意義的。

谷氨酸棒桿菌是公認(rèn)的食品安全性菌株，本研究以谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum) 13032作為宿主細(xì)胞，異源表達(dá)了經(jīng)密碼子優(yōu)化的密蘇里游動放線菌(Actinoplanesmissouriensis) CICIM B0118(A)來源的葡萄糖異構(gòu)酶，構(gòu)建了重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum13032/pXMJ19-xylA。以重組谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞菌體作為全細(xì)胞催化劑，對D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖的全細(xì)胞催化條件進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系下，實現(xiàn)了HFS-55型高果糖漿的一步法安全合成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株E.coliBL21、C.glutamicum13032及質(zhì)粒pXMJ19均由本實驗室保存。含經(jīng)密碼子優(yōu)化的A.missouriensisCICIM B0118(A)來源的葡萄糖異構(gòu)酶編碼基因xylA(GeneBank登錄號：FJ858195.1)的重組質(zhì)粒pET28a-xylA由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 實驗試劑

限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ、高保真酶、同源重組酶克隆試劑盒，TaKaRa公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；氯霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，上海生物工程(上海)股份有限公司；D-葡萄糖，麥克林；D-果糖，阿拉??；甘油、咪唑、氯化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化鈉10(固體培養(yǎng)基添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂粉)，用于大腸桿菌培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為37 ℃。

腦心浸液(brain heart infusion,BHI)培養(yǎng)基：38.5 g/L，用于谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌株的構(gòu)建

1.2.1.1 重組大腸桿菌E.coliBL21/pXMJ19-xylA的構(gòu)建

以蘇州金唯智生物科技有限公司提供的重組質(zhì)粒pET28a-xylA為模板，以xylA-F：GAAACAGAATTAATTAAGCTT A AAGGAGGGAAATCATGTCTGTCCA-GGCCACACGCGAAG(Hind Ⅲ)和xylA-R：CAAAACAGCCAAGCTGAATTCTTAGCGGGCTCCGAGCAGGTGC(EcoR I)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收純化后的PCR產(chǎn)物與事先用Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切且純化后的pXMJ19線性化質(zhì)粒按同源重組試劑盒說明書進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，得到的重組大腸桿菌命名為E.coliBL21/pXMJ19-xylA，重組質(zhì)粒命名為pXMJ19-xylA。通過轉(zhuǎn)化子菌落PCR和測序分析驗證是否正確。

1.2.1.2 重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum13032/pXMJ19-xylA的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pXMJ19-xylA電轉(zhuǎn)化至C.glutamicum13032感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗證，驗證正確的重組菌株命名為C.glutamicum13032/pXMJ19-xylA。

1.2.2 葡萄糖異構(gòu)酶的表達(dá)

將凍管保存的重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum13032/pXMJ19-xylA首先在BHI固體平板上進(jìn)行劃線活化。之后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接含50 μg/mL氯霉素的10 mL BHI液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)12～24 h后，按1%接種量轉(zhuǎn)接含相同濃度氯霉素的50 mL BHI液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)3～4 h，加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，繼續(xù)于30 ℃搖床中培養(yǎng)12 h，以誘導(dǎo)GI表達(dá)。最后，4 ℃、10 000 r/min下離心10 min收集細(xì)胞，PBS(pH 7.4，0.05 mol/L)緩沖液洗滌2次后懸浮，加入適量溶菌酶后在冰上放置2～3 h，利用超聲破碎儀對細(xì)胞進(jìn)行破碎，設(shè)置參數(shù)：破1 s停3 s，共30 min。細(xì)胞破碎完成后，將破碎液在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，去除細(xì)胞破碎雜質(zhì)，上清液處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.3 重組谷氨酸棒桿菌全細(xì)胞催化性能測試

反應(yīng)體系 (25 mL)：2.5 mL 8 mmol/L MgCl2、2.5 mL 200 μmol/L CoCl2、12.5 mL 2 mol/LD-葡萄糖和1 g重組谷氨酸棒桿菌菌體。70 ℃下反應(yīng)1 h，冰浴5 min 終止反應(yīng)[20]。離心取上清液進(jìn)行HPLC分析。

HPLC檢測條件為：RID示差檢測器，Hi-Plex Ca(300 mm×7.7 mm)色譜柱，流動相為超純水，流速為0.5 mL/min，柱溫為80 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長為210 nm。

1.2.4 全細(xì)胞催化條件優(yōu)化

1.2.4.1 菌體質(zhì)量濃度對全細(xì)胞催化體系的影響

在底物D-葡萄糖質(zhì)量濃度180 g/L、pH 7.0、Mg2+濃度10 mmol/L、Co2+濃度1 mmol/L條件下，控制菌體質(zhì)量濃度分別為20、30、40、50、60 g/L(以細(xì)胞干重計，下同)，70 ℃下反應(yīng)1 h，HPLC檢測轉(zhuǎn)化液中D-果糖含量，以確定最適菌體質(zhì)量濃度。

1.2.4.2 金屬離子對全細(xì)胞催化體系的影響

在菌體質(zhì)量濃度40 g/L、底物D-葡萄糖質(zhì)量濃度180 g/L、pH 7.0條件下，分別添加不同金屬離子Ba2+(1 mmol/L)、Cu2+(1 mmol/L)、Fe2+(1 mmol/L)、Mg2+(10 mmol/L)、Ca2+(1 mmol/L)、Mn2+(1 mmol/L)、Co2+(1 mmol/L)和Zn2+(1 mmol/L)，70 ℃下反應(yīng)1 h，HPLC檢測轉(zhuǎn)化液中D-果糖含量。

1.2.4.3 底物D-葡萄糖質(zhì)量濃度對全細(xì)胞催化體系的影響

在菌體質(zhì)量濃度40 g/L、pH 7.0、Mg2+濃度10 mmol/L、Co2+濃度1 mmol/L條件下，控制全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中底物D-葡萄糖質(zhì)量濃度為18、90、180、270、360 g/L，70 ℃下反應(yīng)1 h，HPLC檢測轉(zhuǎn)化液中D-果糖含量，以確定最適底物質(zhì)量濃度。

1.2.4.4 pH對全細(xì)胞催化體系的影響

在菌體質(zhì)量濃度40 g/L、底物D-葡萄糖質(zhì)量濃度180 g/L、Mg2+濃度10 mmol/L、Co2+濃度1 mmol/L條件下，分別在pH 4.0～10.0(間隔1.0)的反應(yīng)體系下，70 ℃下反應(yīng)1 h，HPLC檢測轉(zhuǎn)化液中D-果糖含量，以確定最適反應(yīng)pH?？疾斓木彌_液包括pH 4.0、5.0、6.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH 7.0、8.0的Tris-HCl 緩沖液、pH 9.0、10.0的甘氨酸-NaOH 緩沖液，濃度均為50 mmol/L。

1.2.4.5 反應(yīng)溫度對全細(xì)胞催化體系的影響

在菌體質(zhì)量濃度40 g/L、底物D-葡萄糖質(zhì)量濃度180 g/L、pH 7.0、Mg2+濃度10 mmol/L、Co2+濃度1 mmol/L條件下，將全細(xì)胞催化體系分別置于40、50、60、70、80 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h，HPLC檢測轉(zhuǎn)化液中D-果糖含量，以確定最適反應(yīng)溫度。

1.2.5 全細(xì)胞生物催化合成高果糖漿

將凍管保存的重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum13032/pXMJ19-xylA在BHI固體平板上劃線活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接含50 μg/mL氯霉素的10 mL BHI液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)12～24 h后，按1%接種量轉(zhuǎn)接含相同氯霉素濃度的200 mL BHI液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)3～4 h，加入IPTG繼續(xù)于30 ℃搖床中培養(yǎng)12 h之后，4 ℃、10 000 r/min下離心10 min收集細(xì)胞，用作全細(xì)胞催化劑。

在最優(yōu)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件(菌體質(zhì)量濃度40 g/L、底物D-葡萄糖質(zhì)量濃度180 g/L、pH 8.0、Mg2+濃度10 mmol/L、Co2+濃度1 mmol/L)下，70 ℃、220 r/min磁力攪拌器上反應(yīng)18 h，每隔3 h采集1 mL樣品，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，獲得的上清液進(jìn)行HPLC分析，檢測D-果糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖異構(gòu)酶編碼基因xylA的克隆與表達(dá)

目前，已商業(yè)化的、用于HFS生產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶，主要來源于凝結(jié)芽孢桿菌、鼠灰鏈霉菌和紅色鏈霉菌。當(dāng)溫度高于60 ℃時，催化效率較低，轉(zhuǎn)化率只能達(dá)到42%～45%。密蘇里游動放線菌來源的葡萄糖異構(gòu)酶具有高溫下酶活力水平高、pH穩(wěn)定范圍為6.0～9.0等特點(diǎn)，這些都有利于HFS的合成。并且，有研究清晰表明了該來源葡萄糖異構(gòu)酶的活性位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)等，為后期理性改造提高酶催化活性、熱穩(wěn)定性等提供了重要借鑒[21]。因此，本研究選用密蘇里游動放線菌來源的葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)行HFS的合成。

將從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到的A.missouriensisCICIM B0118(A)來源的葡萄糖異構(gòu)酶編碼基因的序列[21]，長度為1 185 bp，提交至蘇州金唯智生物科技有限公司人工合成，獲得重組質(zhì)粒pET28a-xylA，以該質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1-a所示,特異性條帶(圖1-a中的泳道1和2)位置與目標(biāo)一致。將同源重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組大腸桿菌E.coliBL21/pXMJ19-xylA。重組大腸桿菌E.coliBL21/pXMJ19-xylA培養(yǎng)獲得的重組質(zhì)粒pXMJ19-xylA電轉(zhuǎn)至C.glutamicum13032，轉(zhuǎn)化子菌落PCR鑒定結(jié)果如圖1-b所示，目的條帶的大小與預(yù)期一致，重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum13032/pXMJ19-xylA構(gòu)建成功，并按照方法1.2.2對重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum13032/pXMJ19-xylA進(jìn)行葡萄糖異構(gòu)酶的誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表達(dá)情況，結(jié)果如圖1-c所示，從圖中泳道2和3可以看出，重組菌株C.glutamicum13032/pXMJ19-xylA在分子質(zhì)量43 kDa處有明顯的蛋白表達(dá)條帶，即葡萄糖異構(gòu)酶在C.glutamicum13032中成功實現(xiàn)表達(dá)。

a-xylA基因的PCR擴(kuò)增(M-2 000 bp核酸marker);b-C.glutamicum 13032/pXMJ19-xylA轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗證結(jié)果(M-10 000 bp核酸marker)；c-葡萄糖異構(gòu)酶的異源表達(dá)(M-protein marker，泳道1-C.glutamicum 13032/pXMJ19細(xì)胞破碎上清液，泳道2～3-C.glutamicum 13032/pXMJ19-xylA細(xì)胞破碎上清液)圖1 葡萄糖異構(gòu)酶的基因克隆和表達(dá)分析Fig.1 Gene cloning and expression analysis of glucose isomerase

2.2 全細(xì)胞催化性能測試

由于全細(xì)胞可保護(hù)酶免受惡劣環(huán)境和剪切力等的影響，而且可以重復(fù)批次轉(zhuǎn)化，反應(yīng)過程也無需添加任何輔因子或輔酶，因此，已逐漸替代粗酶或者純酶廣泛應(yīng)用于目的產(chǎn)物的生物合成[22]。因此，本研究擬利用重組谷氨酸棒桿菌的全細(xì)胞作為催化劑來實現(xiàn)HFS的生物合成。

首先，對重組谷氨酸棒桿菌的全細(xì)胞催化性能進(jìn)行測試，看其是否具備將D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖的能力。結(jié)果如圖2所示，重組谷氨酸棒桿菌全細(xì)胞催化劑可異構(gòu)化D-葡萄糖生成D-果糖，圖中D-葡萄糖出峰時間為17.106 min，D-果糖出峰時間為21.380 min，即重組谷氨酸棒桿菌具有生產(chǎn)HFS的潛力。下一步將針對D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖的全細(xì)胞催化體系進(jìn)行優(yōu)化，探索菌體濃度、二價金屬離子、底物D-葡萄糖濃度、反應(yīng)pH以及反應(yīng)溫度對D-果糖合成的影響。

圖2 轉(zhuǎn)化液的HPLC檢測結(jié)果Fig.2 HPLC detection results of the conversion solution

2.3 全細(xì)胞催化條件的優(yōu)化

2.3.1 菌體濃度對D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)化合成D-果糖的影響

菌體濃度在一定程度上反映了轉(zhuǎn)化體系中葡萄糖異構(gòu)酶含量，因此，菌體濃度的不同可能會對D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖的催化過程產(chǎn)生不同影響，結(jié)果如圖3所示。隨著菌體質(zhì)量濃度升高，D-果糖含量不斷上升；當(dāng)菌體質(zhì)量超過40 g/L時，雖然菌體濃度升高，但D-果糖含量卻下降，可能是菌體濃度過高反而不利于底物輸入和產(chǎn)物輸出，因此，D-果糖含量下降。菌體質(zhì)量濃度為40 g/L時，D-果糖含量最高，為3.1 g/L，即全細(xì)胞催化合成D-果糖的最適菌體質(zhì)量濃度為40 g/L。

圖3 菌體質(zhì)量濃度對D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)化合成D-果糖的影響Fig.3 The effect of cell concentration on D-glucose biotransformation to D-fructose

2.3.2 二價金屬離子對D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)化合成D-果糖的影響

葡萄糖異構(gòu)酶是一種金屬酶，結(jié)合二價金屬離子，D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖的過程需二價金屬離子來輔助異構(gòu)化反應(yīng)，二價金屬離子對葡萄糖異構(gòu)酶有3種作用：活化、穩(wěn)定和提高底物D-葡萄糖的親和力[16]。不同的葡萄糖異構(gòu)酶需要不同的二價金屬離子，目前所報道的大多數(shù)葡萄糖異構(gòu)酶主要以Mg2+、Mn2+、Co2+[23]，或以其中2種金屬離子作為輔助催化劑[24]。

不同二價金屬離子可能對D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖的催化過程產(chǎn)生不同影響，因此，本研究測試了不同二價金屬離子Ba2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+和Zn2+對D-葡萄糖異構(gòu)化合成D-果糖的影響，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，Cu2+、Ca2+和Zn2+的存在不利于D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖，可能是Cu2+、Ca2+和Zn2+會抑制葡萄糖異構(gòu)酶活性，因此，不利于D-果糖合成。而Ba2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+和Co2+的存在則促進(jìn)了D-果糖的合成，尤其是Mg2+和Co2+的存在，使得D-果糖含量分別達(dá)4.95、2.96 g/L，是對照(1.02 g/L)的4.85、2.9倍。

圖4 二價陽離子對D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)化合成D-果糖的影響Fig.4 The effect of divalent cations on on D-glucose biotransformation to D-fructose

2.3.3 底物D-葡萄糖濃度對D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)化合成D-果糖的影響

適當(dāng)提高底物濃度可以加快酶促反應(yīng)速率，促進(jìn)產(chǎn)物合成。由圖5可以看出，底物D-葡萄糖質(zhì)量濃度在0～180 g/L，D-果糖含量隨D-葡萄糖濃度的升高而升高，當(dāng)?shù)孜顳-葡萄糖質(zhì)量濃度為180 g/L時，D-果糖含量達(dá)到最高，為14 g/L。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度高于180 g/L時，D-葡萄糖濃度升高，D-果糖含量反而下降，可能是D-葡萄糖濃度超過一定值后，繼續(xù)升高就會對葡萄糖異構(gòu)酶活性產(chǎn)生抑制，不利于葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖，因此，D-果糖含量下降。

圖5 底物D-葡萄糖質(zhì)量濃度對D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)化合成D-果糖的影響Fig.5 The effect of substrate D-glucose concentration on D-glucose biotransformation to D-fructose

2.3.4 反應(yīng)pH對D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)化合成D-果糖的影響

在D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖過程中，最適pH一般為7.0～9.0，pH對D-果糖的生物轉(zhuǎn)化率影響顯著，少數(shù)葡萄糖異構(gòu)酶在弱酸性pH環(huán)境中有較好的催化活力，弱酸性條件下異構(gòu)化，可以減少副產(chǎn)物生成[25]。由圖6可以看出，本研究選用的經(jīng)密碼子優(yōu)化的A.missouriensisCICIM B0118(A)來源的GI在pH 7.0～9.0，D-果糖含量處于較高水平，分別達(dá)到22.83、24.10、23.56 g/L。而在酸性pH 4.0～6.0及過堿pH 10.0條件下，D-果糖含量水平不高，不利于D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖。

圖6 pH對D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)化合成D-果糖的影響Fig.6 The effect of pH on D-glucose biotransformation to D-fructose

2.3.5 反應(yīng)溫度對D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)化合成D-果糖的影響

先前研究表明，葡萄糖異構(gòu)酶催化的D-葡萄糖異構(gòu)化反應(yīng)是一個熱力學(xué)平衡反應(yīng)，隨著溫度升高，催化平衡向D-果糖生成方向進(jìn)行，高溫有利于D-果糖生成[26]。因此，本研究也針對D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖的全細(xì)胞催化體系的反應(yīng)溫度進(jìn)行了研究(圖7)。A.missouriensisCICIM B0118(A)來源的葡萄糖異構(gòu)酶能耐受的溫度范圍較廣，70 ℃為其生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最適溫度，此時，D-果糖含量為25.34 g/L；反應(yīng)溫度在90 ℃時，D-果糖含量仍處于較高水平，為21.23 g/L，僅較最適反應(yīng)溫度下的D-果糖含量下降了16.22%。已商業(yè)化的葡萄糖異構(gòu)酶Sweetzyme?T因不耐高溫，80 ℃時酶活力下降迅速，不利于D-果糖生成，導(dǎo)致了D-果糖含量嚴(yán)重下降。與其相比，A.missouriensisCICIM B0118(A)來源的葡萄糖異構(gòu)酶更具備高溫催化能力，有利于HFS的工業(yè)化生產(chǎn)。

圖7 反應(yīng)溫度對D-葡萄糖生物轉(zhuǎn)化合成D-果糖的影響Fig.7 The effect of reaction temperature on D-glucose biotransformation to D-fructose

2.4 全細(xì)胞催化合成高果糖漿

在最佳轉(zhuǎn)化條件下，將4 g重組谷氨酸棒桿菌菌體添加到含180 g/L葡萄糖、10 mmol/L Mg2+和1 mmol/L Co2+的100 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中，70 ℃、220 r/min下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每3 h取樣，離心取上清液，HPLC檢測D-果糖含量。結(jié)果如圖8所示，轉(zhuǎn)化前期(0～15 h)，D-果糖濃度隨著底物D-葡萄糖的消耗而逐漸升高，轉(zhuǎn)化15 h時，轉(zhuǎn)化液中剩余的D-葡萄糖質(zhì)量濃度為71.87 g/L，D-果糖質(zhì)量濃度達(dá)到103.23 g/L，轉(zhuǎn)化率為57.35%；之后，D-葡萄糖消耗減緩，反應(yīng)基本趨于平衡，D-果糖濃度幾乎維持恒定，18 h時，轉(zhuǎn)化液中剩余的D-葡萄糖質(zhì)量濃度為70.23 g/L，D-果糖質(zhì)量濃度達(dá)到103.32 g/L，轉(zhuǎn)化率為57.4%。可見，重組菌株C.glutamicum13032/pXMJ19-xylA實現(xiàn)了一步法安全合成HFS-55型高果糖漿，為HFS-55型高果糖漿的可持續(xù)化、安全工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要借鑒。

圖8 全細(xì)胞催化D-葡萄糖異構(gòu)化為D-果糖Fig.8 Whole cells catalyze the isomerization of D-glucose to D-fructose

3 討論

高果糖漿因具有甜味純正、滲透壓高、吸潮性好、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、烘焙、醫(yī)藥等領(lǐng)域。目前，一步法生物合成HFS-55已取得一定成效，但其宿主細(xì)胞大多是大腸桿菌。在催化過程中，大腸桿菌可能會將不符合食品衛(wèi)生要求的有害物質(zhì)帶入產(chǎn)品中，因此，實現(xiàn)葡萄糖異構(gòu)酶在研究背景清晰的食品安全菌株中的異源表達(dá)，以一步法安全合成HFS-55型高果糖漿是非常有意義的。已有研究者在食品安全菌株枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)了葡萄糖異構(gòu)酶，但其轉(zhuǎn)化率均不超過52%[27-28]。

本文首次成功實現(xiàn)了A.missouriensisCICIM B0118(A)來源的葡萄糖異構(gòu)酶在食品安全菌株C.glutamicum13032中的異源表達(dá)，構(gòu)建了重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum13032/pXMJ19-xylA，并以其菌體作為全細(xì)胞催化劑，對D-葡萄糖異構(gòu)化生成D-果糖的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件(菌體濃度、二價金屬離子、底物濃度、pH、溫度)進(jìn)行優(yōu)化。在最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件下，連續(xù)轉(zhuǎn)化18 h，D-果糖質(zhì)量濃度達(dá)到103.32 g/L，轉(zhuǎn)化率為57.4%，實現(xiàn)了HFS-55型高果糖漿的一步法安全生物合成。研究發(fā)現(xiàn)A.missouriensisCICIM B0118(A)來源的葡萄糖異構(gòu)酶在較寬的溫度(60～90 ℃)、pH (7.0～9.0)范圍內(nèi)仍具有較好活性，能更好地應(yīng)用于HFS-55型高果糖漿的工業(yè)化生產(chǎn)。本研究只進(jìn)行了初步探索，并未對高果糖漿的合成進(jìn)行放大試驗，今后將針對HFS-55型高果糖漿的5 L發(fā)酵罐水平進(jìn)行研究，并針對葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)行理性改造，提高葡萄糖異構(gòu)酶活力水平，加快其生物轉(zhuǎn)化速率，以實現(xiàn)HCS-55型高果糖漿的可持續(xù)化、高效、安全的工業(yè)化生產(chǎn)。