趙海林 胡骕 彭彪 羅冬冬 李丹

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科（廣州510095）

膠質(zhì)瘤屬于一種較為常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，惡性程度較高，臨床發(fā)病率、預(yù)后死亡率均處于較高的水平，就目前現(xiàn)有的醫(yī)療水平而言，尚無治療方法，多采用早期手術(shù)、放化療手段治療，但部分患者經(jīng)臨床常規(guī)治療后患者3年生存率仍較低［1-3］。因此積極尋找有效治療膠質(zhì)瘤的藥物對(duì)延長膠質(zhì)瘤患者生存周期具有重要意義。阿魏酸鈉屬于一種非肽類內(nèi)皮素受體拮抗劑，是阿魏酸的一種鈉鹽，其目前主要應(yīng)用于腎臟疾病、糖尿病、心腦血管疾病的治療中，但近年來有報(bào)道稱其具有抗腫瘤作用［4-5］。有研究顯示［6］，阿魏酸鈉可以增加人EBL?7404 肝癌細(xì)胞的凋亡、抑制其生存性?；诖?，本次主要研究使用阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分析其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以明確其是否具有抗腫瘤作用，為臨床上膠質(zhì)瘤的藥物治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 研究細(xì)胞及試劑來源膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251由上海雅吉生物科技有限公司提供。試劑來源：阿魏酸鈉（成都亨達(dá)藥業(yè)有限公司）；環(huán)磷酰胺（深圳海思安生物技術(shù)有限公司）；MTT 試劑（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司）；胎牛血清［漢恒生物工程（上海）有限公司］；DMEM 培養(yǎng)基（武漢益普生物科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（上海廣銳生物科技有限公司）；小鼠抗大鼠p?JAK2 抗體、兔抗大鼠p?STAT3抗體（武漢菲恩生物科技有限公司）。本次研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)取所購買的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，使用第3～ 9 代的細(xì)胞按照1∶4 的比例做傳代培養(yǎng)，加入15 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、2.5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長大約為90%時(shí)，使用含0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基阻斷24 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 阿魏酸鈉的LC50及實(shí)驗(yàn)分組、最佳有效時(shí)間測定取所培養(yǎng)的細(xì)胞，采用MTT 法測定阿魏酸鈉在1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/mL 各濃度下對(duì)細(xì)胞的抑制率，設(shè)定量效關(guān)系曲線，計(jì)算阿魏酸鈉的LC50，確定阿魏酸鈉的低、中、高濃度，分別作為低濃度組、中濃度組、高濃度組。

1.2.3 阿魏酸鈉干預(yù)將細(xì)胞分為常規(guī)培養(yǎng)的空白組、使用環(huán)磷酰胺（30 μmol/L）培養(yǎng)的陽性對(duì)照組，高濃度組、中濃度組、低濃度組分別使用0.3、0.03、0.003 mg/mL 阿魏酸鈉培養(yǎng)。在培養(yǎng)72 h 后觀察細(xì)胞生物學(xué)行為。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測采用MTT 法測定細(xì)胞增殖情況，取各組細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×104個(gè)/mL，將200 μL 細(xì)胞懸液接種于96 孔板上，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)72 h，加入10 μL MTT 試劑，孵育4 h，計(jì)算細(xì)胞增殖率，使用酶標(biāo)儀檢測波長為570 mm 細(xì)胞的OD值。重復(fù)檢測3 次取均值，細(xì)胞增殖率=（細(xì)胞組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測采用TUNEL 法測定細(xì)胞凋亡情況，在熒光顯微鏡下做細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)，根據(jù)洗滌、DAPI 染色封片后細(xì)胞核顏色情況判定細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞核為綠色熒光表示陽性，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光表示陰性，重復(fù)檢測3 次取均值。細(xì)胞凋亡率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 細(xì)胞遷移檢測細(xì)胞遷移能力使用劃痕實(shí)驗(yàn)測定，取所培養(yǎng)的細(xì)胞在18 孔板上接種，待細(xì)胞生長至80%時(shí)，使用槍頭（100 μL）做垂直劃直線操作，之后使用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，加入血清培養(yǎng)基（0.5%），72 h 后使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況。遷移率=（0 h 細(xì)胞間距-觀察時(shí)間細(xì)胞間距）/0 h 細(xì)胞間距。每次重復(fù)測量5 次，取均值。

1.2.7 細(xì)胞侵襲檢測細(xì)胞侵襲能力使用Tran?swell 小室（美國Corning 公司）測定，蘇木晶染色、PBS 清洗，使用倒置顯微鏡觀察5 個(gè)不同視野細(xì)胞侵襲情況，做細(xì)胞侵襲計(jì)數(shù)，細(xì)胞侵襲計(jì)數(shù)為每個(gè)視野的穿模細(xì)胞數(shù)。每次重復(fù)測量5 次，取均值。

1.2.8 JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)檢測細(xì)胞JAK2/STAT3 通路蛋白p?JAK2、p?STAT3 表達(dá)情況使用Western blot 法測定，對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞做離心、蛋白提取，提取完成后使用BCA 做蛋白定量測定，將所提取的50 μg 蛋白加入至2×SDS 凝膠緩沖液中，做電泳、轉(zhuǎn)膜、取膜、固定、封閉處理，將1∶1 000 比例的TBST 稀釋的p?JAK2、p?STAT3 一抗，在溫度為4 ℃的環(huán)境下孵育過夜，TBST 重復(fù)做3 次洗膜處理，加入1∶10 000 TBST 稀釋的二抗，搖動(dòng)孵育60 min，TBST 重復(fù)做3 次洗膜處理，使用DAB做顯色處理，分析蛋白表達(dá)情況。以GAPDH 蛋白為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸鈉的LC50 及實(shí)驗(yàn)分組測定結(jié)果如表1所示，MTT 檢測發(fā)現(xiàn)，阿魏酸鈉在1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/mL 各濃度下對(duì)細(xì)胞的抑制率逐漸降低，經(jīng)計(jì)算其LC50=0.307 5 mg/mL，繪制量效關(guān)系曲線發(fā)現(xiàn)，在1～ 10-3mg/mL 對(duì)細(xì)胞增殖的抑制較為明顯，結(jié)合藥物的LC50，設(shè)定本次研究的阿魏酸鈉高、中、低濃度分別為0.3、0.03、0.003 mg/mL，分別作為低濃度組、中濃度組、高濃度組，見圖1。

圖1 阿魏酸鈉量效關(guān)系曲線Fig.1 The dose?effect relationship curve of sodium ferulate

表1 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響Tab.1 The effect of sodium ferulate on the proliferation of glioma cells±s

表1 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響Tab.1 The effect of sodium ferulate on the proliferation of glioma cells±s

阿魏酸鈉濃度（mg/mL）1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 OD 值0.19±0.02 0.23±0.04 0.33±0.03 0.40±0.03 0.41±0.02 0.42±0.03 0.43±0.05抑制率（%）78.65 65.26 22.35 15.63 4.62 5.33 5.62

2.2 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響與空白組相比，陽性對(duì)照組、低、中、高濃度組增殖率降低，凋亡率升高；與陽性對(duì)照組相比，低、中、高濃度組增殖率降低，凋亡率升高（P< 0.05）；與低濃度組相比，中、高濃度組增殖率降低，凋亡率升高（P< 0.05）；與中濃度組相比，高濃度組增殖率降低，凋亡率升高（P<0.05）。見表2。

表2 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響Tab.2 The effect of sodium ferulate on the proliferation and apoptosis of glioma cells±s，%

表2 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響Tab.2 The effect of sodium ferulate on the proliferation and apoptosis of glioma cells±s，%

注：與空白組相比，aP < 0.05；與陽性對(duì)照組相比，bP < 0.05；與低濃度組相比，cP<0.05；與中濃度組相比，dP<0.05

組別空白組陽性對(duì)照組低濃度組中濃度組高濃度組F 值P 值細(xì)胞增殖率42.35±5.59 30.16±3.39a 21.03±2.16ab 10.35±1.33abc 2.67±0.24abcd 33.640 0.001細(xì)胞凋亡率10.13±1.02 22.35±2.06a 42.26±4.15ab 61.13±6.33abc 78.25±7.16abcd 44.678 0.001

2.3 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移的影響與空白組相比，陽性對(duì)照組、低、中、高濃度組侵襲數(shù)、遷移率降低（P< 0.05）；與陽性對(duì)照組相比，低、中、高濃度組侵襲數(shù)、遷移率降低（P< 0.05）；與低濃度組相比，中、高濃度組侵襲數(shù)、遷移率降低（P<0.05）；與中濃度組相比，高濃度組侵襲數(shù)、遷移率降低（P<0.05）。見表3。

表3 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移的影響Tab.3 The effect of sodium ferulate on the invasion and migration of glioma cells±s

表3 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移的影響Tab.3 The effect of sodium ferulate on the invasion and migration of glioma cells±s

注：與空白組相比，aP < 0.05；與陽性對(duì)照組相比，bP < 0.05；與低濃度組相比，cP<0.05；與中濃度組相比，dP<0.05

組別空白組陽性對(duì)照組低濃度組中濃度組高濃度組F 值P 值細(xì)胞侵襲數(shù)（個(gè)）1 795.68±142.26 1 023.35±104.25a 762.35±78.96ab 425.66±46.35abc 215.26±20.34abcd 52.166 0.001細(xì)胞遷移率（%）68.59±7.46 48.65±3.35a 22.19±2.00ab 16.35±1.62abc 5.13±0.37abcd 40.301 0.001

2.4 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)的影響與空白組相比，陽性對(duì)照組、低、中、高濃度組p?JAK2、p?STAT3 蛋白表達(dá)量降低（P< 0.05）；與陽性對(duì)照組相比，低、中、高濃度組p?JAK2、p?STAT3 蛋白表達(dá)量降低（P<0.05）；與低濃度組相比，中、高濃度組p?JAK2、p?STAT3 蛋白表達(dá)量降低（P<0.05）；與中濃度組相比，高濃度組p?JAK2、p?STAT3 蛋白表達(dá)量降低（P< 0.05）。見表4、圖2。

表4 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)的影響Tab.4 The effect of sodium ferulate on the expression of JAK2/STAT3 pathway protein in glioma cells±s

表4 阿魏酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)的影響Tab.4 The effect of sodium ferulate on the expression of JAK2/STAT3 pathway protein in glioma cells±s

注：與空白組相比，aP < 0.05；與陽性對(duì)照組相比，bP < 0.05；與低濃度組相比，cP<0.05；與中濃度組相比，dP<0.05

組別空白組陽性對(duì)照組低濃度組中濃度組高濃度組F 值P 值p?JAK2 1.06±0.25 0.76±0.08a 0.44±0.06ab 0.35±0.05abc 0.12±0.02abcd 17.778 0.001 p?STAT3 1.33±0.16 1.02±0.10a 0.81±0.07ab 0.50±0.05abc 0.26±0.04abcd 30.774 0.001

圖2 JAK2/STAT3 通路蛋白Western Blot 圖Fig.2 Western blot map of JAK2/STAT3 pathway protein

3 討論

膠質(zhì)瘤惡性程度較高，患者大多預(yù)后不良，因此有效的治療手段對(duì)控制患者疾病發(fā)展、改善具有重要的意義［7］。阿魏酸鈉是從當(dāng)歸或川芎中提取的水溶性有效成分，對(duì)多種腫瘤具有治療效果［8］。因此，本研究旨在研究阿魏酸鈉通過調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響。

目前已有許多研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸具有較強(qiáng)的抗癌活性，如抑制宮頸癌裸鼠移植瘤生長［9］、人肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡［10］、誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞周期阻滯和自噬［11］以及調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為［12］等。阿魏酸鈉是阿魏酸的一種鈉鹽，其作用與阿魏酸作用一致。因此筆者推測，阿魏酸鈉可能具有抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)凋亡的作用，本研究中選取膠質(zhì)瘤細(xì)胞，使用不同濃度的阿魏酸鈉進(jìn)行培養(yǎng)，分析其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與使用環(huán)磷酰胺培養(yǎng)的細(xì)胞相比，使用阿魏酸鈉培養(yǎng)的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力明顯被抑制，且明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，此結(jié)果提示著，阿魏酸鈉具有一定的抗膠質(zhì)瘤作用。阿魏酸屬酚酸的一種，其廣泛存在于植物中，具有較強(qiáng)的抗氧化性、抗炎、抗菌、防心血管疾病以及抗癌作用等，近年來在臨床上被認(rèn)為屬于一種抗癌物質(zhì)［13］。阿魏酸鈉具有抗氧化、抗血小板聚集、神經(jīng)保護(hù)、增強(qiáng)免疫功能等，影響著膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為［14-15］。

近年來隨著對(duì)此信號(hào)通路的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，其在惡性腫瘤中具有促進(jìn)過程，在細(xì)胞癌變過程中，JAK2/STAT3 通路中的JAK2 磷酸化，其在磷酸化水平上可激活STAT3 表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞異常增殖，最終促使疾病進(jìn)一步惡化，危及生命［16-18］。有研究表明［19］，JAK2/STAT3 通路可以抑制的炎性介質(zhì)釋放，有效地減輕肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷。有研究發(fā)現(xiàn)［20］，通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路活化，可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)，從而影響到膠質(zhì)瘤。有研究發(fā)現(xiàn)［21］，JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活影響著膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，影響著細(xì)胞的增殖、凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)［22］，阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路促使膠質(zhì)瘤細(xì)胞增加，凋亡減少，細(xì)胞增殖率、遷移率較低，影響膠質(zhì)瘤的恢復(fù)。本文研究結(jié)果顯示，經(jīng)阿魏酸鈉干預(yù)后細(xì)胞中JAK2/STAT3 通路JAK2 磷酸化和STAT3 表達(dá)明顯被抑制，且呈劑量依賴，此結(jié)果提示著，阿魏酸鈉可能經(jīng)促使此信號(hào)通路失活而發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤的作用。分析原因：JAK2/STAT3信號(hào)通路參與神經(jīng)元分化、增殖、炎癥反應(yīng)等在機(jī)體多種病理過程［23］。JAK2/STAT3 通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有明顯的促進(jìn)作用，經(jīng)抑制此信號(hào)通路活性可發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤的作用［24-25］。

綜上所述，阿魏酸鈉可能通過JAK2/STAT3 通路作用于膠質(zhì)瘤，促使此通路失活而發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)凋亡的作用。但是，本文研究樣本較少，還需進(jìn)一步的研究。