農(nóng)常亮 黃楚洪 馮金明 徐千惠 何瀟 莫錦麗 史學(xué)凱 黃玉維

南寧市第二人民醫(yī)院1兒科，2介入超聲科（南寧530031）

氧療是臨床常用的治療措施之一，可顯著提高血氧飽和度，滿足機(jī)體組織器官對(duì)氧氣的需求［1］。高濃度氧療被廣泛應(yīng)用于危重新生兒救治中，大幅度提升了低血壓癥新生兒及早產(chǎn)兒存活率，但長(zhǎng)時(shí)間處于高氧環(huán)境可造成肺損傷，進(jìn)而發(fā)展為不可逆性肺纖維化，造成新生兒支氣管肺發(fā)育不良，嚴(yán)重影響患兒成長(zhǎng)［2］。目前臨床對(duì)新生兒高氧肺損傷尚無有效治療手段，多采用激素類抗炎藥物及肺表面活性劑，但效果不理想且副作用強(qiáng)，故未能得到推廣。因此，尋找安全、高效的預(yù)防方式，對(duì)于預(yù)防及改善新生兒高氧肺損傷、減少肺功能障礙、癱瘓、智力發(fā)育緩慢等后遺癥具有積極意義。人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，G?Rb1）是自中藥人參中提取的一種固醇類化合物，具有多種生物學(xué)功能，如抗氧化、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、延緩衰老、提升記憶力等［3］。有研究表明［4］，G?Rb1 可降低大鼠肺泡組織氧化酶活性，減緩慢阻肺病理改變，從而治療肺氣腫，提示其肺功能保護(hù)作用。然而，目前鮮有關(guān)于其對(duì)新生兒高氧肺損傷治療的研究。本研究通過建立新生仔鼠高氧肺損傷模型，觀察G?Rb1 對(duì)新生仔鼠高氧肺損傷的改善作用，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)SD 大鼠20 只，雌雄比例各半，9 周齡，體質(zhì)量（300±50）g，購自上海靈暢生物科技有限公司，生產(chǎn)許可SCXK（滬）2018?0003。

1.2 藥物、主要試劑、儀器G?Rb1（純度>99%），上海滬震實(shí)業(yè)有限公司；核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor?E2 related factor2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements，ARE）通路抑制劑ML385，上海一研生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、肺表面活性物質(zhì)蛋白?D（alveolar surface active substance?D，SP?D）酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunoser?bent assay，ELISA）試劑盒，上海江萊生物科技有限公司；兔抗大鼠Nrf2、醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1］一抗，美國(guó)R&D公司。

Elx808 酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 公司；CKX41 顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；JY600 電泳儀、JY04S?3 凝膠成像分析系統(tǒng)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 新生仔鼠高氧肺損傷模型建立及干預(yù)［5-7］將雌雄SD 大鼠按1∶1 比例合籠配對(duì)，獲得孕鼠7 只，共得73 只新生仔鼠，3 d 后隨機(jī)分為空白組（18 只）、模型組（19 只）、Rb1 組（18 只）、Rb1 聯(lián)合ML385 組（18 只）。除空白組外的各組仔鼠建立高氧肺損傷模型，將仔鼠與其母鼠分別置于玻璃氧箱內(nèi)，輸入氧氣使氧箱內(nèi)氧氣濃度維持在80%，濕度維持在50%～ 70%，空白組同樣置于玻璃氧箱內(nèi)，輸入正?？諝猓溆鄺l件同其他組，保持7 d。每日開箱1 h，期間Rb1 聯(lián)合ML385 組腹腔注射G?Rb1（10 mg/kg），10 min 后灌胃ML385 生理鹽水溶液（20 mg/kg），Rb1 組腹腔注射G?Rb1（10 mg/kg），灌胃等量生理鹽水，空白組、模型組腹腔注射等量生理鹽水，灌胃等量生理鹽水，每日1 次，干預(yù)7 d。干預(yù)期間，模型組、Rb1聯(lián)合ML385組死亡5只仔鼠，Rb1 組死亡3 只。

1.4 組織取材干預(yù)結(jié)束后次日，各組隨機(jī)選取12 只仔鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，脫頸處死，其中6 只開胸取全肺，稱取肺濕重，后放入65 ℃恒溫箱，干燥24 h 后取出稱取干重。計(jì)算肺濕/干重比（W/D 值）=全肺濕重/全肺干重；剩余6 只暴露氣管后左肺注入預(yù)冷生理鹽水，行支氣管肺泡灌洗術(shù)，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），4 ℃1 200 r/min離心8 min（離心半徑10 cm），取其上清液，分成3 份，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，用于后續(xù)檢測(cè)；切取部分右肺組織，分成兩份，一份置于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片機(jī)切為4 μm 厚度連續(xù)切片用于HE 染色，一份放入-80 ℃冰箱保存，用于Western blot 實(shí)驗(yàn)。

1.5 BALF中MDA、SOD活性水平及SP?D含量檢測(cè)取冷凍保存的BALF，按照試劑盒說明書要求設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA 含量，羥胺法檢測(cè)SOD 活性；采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunoserbent assay，ELISA）檢測(cè)BALF 中SP?D 含量，根據(jù)試劑盒說明書要求設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 位置吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SP?D 含量。

1.6 HE 染色觀察肺組織病理學(xué)變化取肺組織切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水洗，蒸餾水沖洗2 min，蘇木精液染色5 min，蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分色，蒸餾水浸泡10 min，促藍(lán)液藍(lán)化，蒸餾水沖洗，伊紅液復(fù)染2 min，常規(guī)脫水、透明，中性樹脂封固，置于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，并拍照記錄。

1.7 肺組織Nrf2、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)取冷凍保存的肺組織，眼科剪剪碎，研磨器充分研磨，PBS 勻漿，加入預(yù)冷的RIPA 裂解液，置于離心管內(nèi)，8 500 r/min 離心15 min（離心半徑12 cm），采用BCA 法提取總蛋白并定量。取40 μg 待測(cè)樣本，與5 倍體積上樣緩沖液混勻，水浴加熱沸騰5 min 變性蛋白，同條件離心取上清，電壓80 V 行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉2 h，TBST洗膜，加入兔抗大鼠Nrf2、NQO1一抗（工作濃度1∶500），4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜，加入二抗（工作濃度1∶2 000），常溫孵育2 h，ECL顯色，暗室曝光，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，蛋白表達(dá)量為條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用IBM SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差分析檢驗(yàn)多樣本計(jì)量資料，以t檢驗(yàn)行兩樣本比較。P<0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組仔鼠肺W/D 值比較空白組、模型組、Rb1 組、Rb1 聯(lián)合ML385 組新生仔鼠肺W/D 值分別為（4.97 ± 0.52）、（5.87 ± 0.61）、（5.19 ± 0.54）、（5.38 ± 0.56），與空白組比較，模型組肺W/D 值升高（P< 0.05）；與模型組比較，Rb1 組肺W/D 值降低（P<0.05）；與Rb1 組比較，Rb1 聯(lián)合ML385 組肺W/D 值升高（P<0.05）。

2.2 各組仔鼠BALF 中MDA、SOD 活性水平比較與空白組比較，模型組MDA 水平升高，SOD活性降低（P< 0.05）；與模型組比較，Rb1 組肺MDA 水平降低，SOD 活性升高（P< 0.05）；與Rb1組比較，Rb1 聯(lián)合ML385 組水平升高，SOD 活性降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組BALF 中MDA、SOD 活性水平比較Tab.1 Comparison of MDA and SOD activity levels of BALF in each group ±s

表1 各組BALF 中MDA、SOD 活性水平比較Tab.1 Comparison of MDA and SOD activity levels of BALF in each group ±s

注：與空白組比較，aP < 0.05；與模型組比較，bP < 0.05；與Rb1組比較，cP<0.05

組別空白組模型組Rb1 組Rb1 聯(lián)合ML385 組F 值P 值例數(shù)6 6 6 6 MDA（nmol/mg）0.31±0.04 0.78±0.09a 0.50±0.07b 0.62±0.07c 48.359<0.001 SOD（UN/mg）8.59±1.27 5.86±0.69a 7.71±0.88b 6.20±0.75c 11.534<0.001

2.3 各組仔鼠SP?D 水平比較空白組、模型組、Rb1 組、Rb1 聯(lián)合ML385 組新生仔鼠SP?D 含量分別為（2.58 ± 0.26）ng/L、（4.71 ± 0.50）ng/L、（3.04 ±0.31）ng/L、（4.12 ± 0.43）ng/L，與空白組比較，模型組SP?D 水平升高（P< 0.05）；與模型組比較，Rb1組SP?D 水平降低（P< 0.05）；與Rb1 組比較，Rb1聯(lián)合ML385 組SP?D 水平升高（P<0.05）。

2.4 各組仔鼠肺組織病理學(xué)變化HE 染色結(jié)果顯示，空白組肺組織完整，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，無病理學(xué)變化；模型組肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡間距增加，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；Rb1 組和Rb1 聯(lián)合ML385 組肺組織結(jié)構(gòu)異常，肺泡間距增加較少，炎性細(xì)胞數(shù)量浸潤(rùn)程度均低于模型組，Rb1 組比Rb1聯(lián)合ML385 組病理改善更明顯。見圖1。

圖1 HE 染色觀察各組肺組織病理變化（×200，標(biāo)尺50 μm）Fig.1 HE staining to observe the pathological changes of lung tissues in each group（×200，scale 50 μm）

2.5 各組仔鼠肺組織Nrf2、NQO1 蛋白表達(dá)量比較與空白組比較，模型組Nrf2、NQO1 蛋白表達(dá)量升高（P< 0.05）；與模型組比較，Rb1 組肺Nrf2、NQO1 蛋白表達(dá)量升高（P< 0.05）；與Rb1 組比較，Rb1 聯(lián)合ML385 組Nrf2、NQO1 蛋白表達(dá)量降低（P<0.05）。見表2、圖2。

圖2 各組仔鼠肺組織Nrf2、NQO1 蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of Nrf2 and NQO1 protein in the lung tissues of offspring in each group

表2 各組肺組織Nrf2、NQO1 蛋白表達(dá)量比較Tab.2 Comparison of Nrf2 and NQO1 protein expression of lung tissues in each group ±s

表2 各組肺組織Nrf2、NQO1 蛋白表達(dá)量比較Tab.2 Comparison of Nrf2 and NQO1 protein expression of lung tissues in each group ±s

注：與空白組比較，aP < 0.05；與模型組比較，bP < 0.05；與Rb1組比較，cP<0.05

組別空白組模型組Rb1 組Rb1 聯(lián)合ML385 組F 值P 值例數(shù)6 6 6 6 MDA（nmol/mg）0.31±0.04 0.78±0.09a 0.50±0.07b 0.62±0.07c 48.359<0.001 SOD（UN/mg）8.59±1.27 5.86±0.69a 7.71±0.88b 6.20±0.75c 11.534<0.001

3 討論

高氧肺損傷以肺泡上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷為主要病理改變，表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸窘迫、低氧血癥，威脅患兒生命健康［8］。目前新生兒高氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明，一般認(rèn)為與氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫細(xì)胞異?；罨?、肺表面活性物質(zhì)改變、炎性細(xì)胞因子增多、毛細(xì)血管屏障破壞、細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制被大多數(shù)人所認(rèn)同［9］。由于新生兒肺發(fā)育不全、抗氧化酶活性低，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)超負(fù)荷，打破氧化?抗氧化動(dòng)態(tài)平衡，肺組織氧自由基過量，造成氧中毒，直接損傷肺組織細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)，招募并激活免疫細(xì)胞，進(jìn)一步損傷肺組織［10］。

新生SD 仔鼠在免疫反應(yīng)、病理生理及組織發(fā)育等方面與新生兒相似性很強(qiáng)，采用該仔鼠建立高氧肺損傷模型，并在該基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究可行性與科學(xué)性較強(qiáng)。肺W/D 值是肺部水腫程度的直接指標(biāo)，可反映肺損傷程度，肺損傷后大量液體滲出轉(zhuǎn)移至肺間質(zhì)，肺濕重增大，W/D 值升高［11-12］。MDA 是機(jī)體內(nèi)自由基與細(xì)胞脂質(zhì)膜的過氧化產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等物質(zhì)交聯(lián)，破壞生物膜，其水平可反映機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)嚴(yán)重程度，SOD 是氧自由基清除酶，廣泛分布于機(jī)體代謝器官組織，可維持機(jī)體氧化?抗氧化動(dòng)態(tài)平衡，其活性水平可反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力［13］。SP?D 是一種大分子表面活性蛋白，作為肺部重要的免疫調(diào)節(jié)劑，在免疫防御過程中發(fā)揮重要作用，其可識(shí)別并結(jié)合微生物、非微生物顆?；驂乃兰?xì)胞，提升免疫細(xì)胞的吞噬能力及殺傷力，又可間接調(diào)控促炎因子，保護(hù)肺損傷，可作為高氧肺損傷的生物標(biāo)記物［14］。人參是我國(guó)名貴中藥材，取自五加科植物人參的干燥根，性溫，味甘、微苦、微溫，歸脾，肺經(jīng)，可補(bǔ)氣固脫、補(bǔ)脾益肺、安益智神，張?jiān)厮夺t(yī)學(xué)啟源》記載，可治肺氣促，短氣、少氣，補(bǔ)中緩中，瀉肺脾胃中火邪［15］。G?Rb1 是人參主要活性成分之一，可提升神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，改善心肌功能，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。SHAUKAT 等［16］研究認(rèn)為，G?Rb1 可緩解過度炎癥導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征，從而對(duì)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠產(chǎn)生治療作用，提示G?Rb1 在肺部疾病中的作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，Rb1 組肺W/D 值、MDA 水平、SP?D 水平降低，SOD 活性升高，提示G?Rb1 可改善新生仔鼠肺損傷，提升機(jī)體抗氧化能力。

Nrf2/ARE 信號(hào)通路是機(jī)體重要的抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路，在多種疾病的氧化?抗氧化動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)過程中扮演重要角色，其中Nrf2 是CNC 調(diào)節(jié)蛋白家族成員，是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，ARE 是機(jī)體重要的抗氧化反應(yīng)驅(qū)動(dòng)序列，可被多種氧化性物質(zhì)激活，啟動(dòng)抗氧化酶轉(zhuǎn)錄，NQO1 是Nrf2 下游抗氧化靶蛋白，可降解毒性化合物，抑制其參與氧化還原反應(yīng)［17-18］。機(jī)體正常狀態(tài)下，Nrf2 與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch?like ECH?associated protein 1，Keap1）結(jié)合低表達(dá)于胞質(zhì)中，當(dāng)受到氧自由基刺激后，Nrf2 表達(dá)升高并與Keap1分離，轉(zhuǎn)移至胞核與ARE 序列結(jié)合，激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，啟動(dòng)多個(gè)下游基因如NQO1 轉(zhuǎn)錄，大量釋放抗氧化酶，不同因子相互作用進(jìn)一步提升機(jī)體抗氧化能力［19-20］。LIAN 等［21］研究認(rèn)為，激活Nrf2/ARE 通路可減輕間歇性缺氧誘導(dǎo)的肺損傷，從而治療阻塞性睡眠呼吸暫停大鼠，提示Nrf2/ARE 通路對(duì)肺部的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，Rb1 組肺Nrf2、NQO1 蛋白表達(dá)量升高，且在G?Rb1 基礎(chǔ)上增用Nrf2/ARE 通路抑制劑ML385 可減弱G?Rb1對(duì)高氧肺損傷的改善作用，提示可能通過介導(dǎo)該通路，抑制肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對(duì)高氧肺損傷新生仔鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。目前關(guān)于G?Rb1 毒理學(xué)安全性的系統(tǒng)研究尚少，盡管天然食物及傳統(tǒng)中草藥成分常規(guī)食用是安全的，但其有效成分經(jīng)過現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)提煉、濃縮后的安全資料相對(duì)缺乏。田輝等［22］在觀察人參皂甙的安全性時(shí)發(fā)現(xiàn)，其符合特殊食品安全毒理學(xué)要求。但有學(xué)者認(rèn)為［23］，暴露于50 μg/mL 的胚胎與未暴露的胚胎相比具有顯著較低的中位形態(tài)學(xué)評(píng)分，提示其具有一定的胚胎毒性。但因其應(yīng)用時(shí)間較短且較少應(yīng)用于臨床，安全性仍有待長(zhǎng)期觀察，尤其應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其應(yīng)用于妊娠患者中的安全性的關(guān)注。

綜上所述，G?Rb1 可改善新生仔鼠肺損傷，提升機(jī)體抗氧化能力，抑制肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活Nrf2/ARE 通路可能是其發(fā)揮作用的機(jī)制之一。然而，G?Rb1 對(duì)肺損傷的治療可能通過多條通路發(fā)揮作用，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需進(jìn)一步研究。