姜德坤，張惠榮，潘金勇，馬雯晴，劉 輝，董麗麗

德朗熱綜合征(Cornelia de Lange syndrome，CdLS)是一種以生長發(fā)育遲緩、嚴(yán)重認(rèn)知障礙、特征性面容、肢體發(fā)育畸形為特點(diǎn)的遺傳性疾病[1]。NIPBL基因?yàn)橹饕虏』騕2]，其表達(dá)水平越低則病情越嚴(yán)重，在CdLS診斷中首要檢測指標(biāo)是確定NIPBL基因是否突變[3]。研究[4]表明其肢體發(fā)育畸形發(fā)生率高達(dá)73.1%。前期研究[5]表明NIPBL基因低表達(dá)會抑制shh、Wnt5a基因及其蛋白的表達(dá)，從而影響Wnt信號通路相關(guān)分子的表達(dá)。推測NIPBL基因可能通過Wnt信號通路調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，但其具體機(jī)制尚未見報(bào)道。該研究用慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沉默NIPBL基因，探究成骨相關(guān)基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX-2)的表達(dá)，以揭示NIPBL基因?qū)撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象原代小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 試劑與儀器DMEM/F-12培養(yǎng)基(美國gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(美國Thermo公司)；CCK-8試劑盒(上海東仁化學(xué)科技有限公司)；堿性磷酸酶試劑盒(美國Cyagen公司)；RUNX2抗體、BMP2抗體、Osteocalcin抗體(英國Abcam公司)；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；慢病毒(上海吉瑪基因公司)；倒置相差熒光顯微鏡(日本Nicon公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1NIPBL基因慢病毒載體構(gòu)建 針對NIPBL目標(biāo)基因序列，設(shè)計(jì)3條NIPBL-siRNA，分別為siRNA1:5′-GCAGATGCCTGTCTTACAACT-3′; siRNA2: 5′-GCATCCGAGTCTAATGTTTGA-3′;siRNA3:5′-GC AGGATACATGCCATATTCC-3′。陰性對照序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。慢病毒載體的構(gòu)建由上海吉瑪基因股份有限公司完成。

1.3.2慢病毒轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn) 接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，設(shè)置感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為10、30、60、100。轉(zhuǎn)染后72 h在相差熒光顯微鏡下觀察結(jié)果(圖1)。轉(zhuǎn)染效率的測定：在200倍視野下均勻測定10個(gè)視野的細(xì)胞總數(shù)和帶熒光細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率=10個(gè)視野內(nèi)帶熒光細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。當(dāng)MOI=60時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)94%，設(shè)為最適感染復(fù)數(shù)。

圖1 不同MOI轉(zhuǎn)染結(jié)果(倒置相差熒光顯微鏡 ×100)A：MOI=10；B：MOI=30；C：MOI=60；D：MOI=100

1.3.3慢病毒轉(zhuǎn)染 該實(shí)驗(yàn)分為5組：① siRNA1組：用攜帶NIPBL-siRNA1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；② siRNA2組：用攜帶NIPBL-siRNA2的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；③ siRNA3組：用攜帶NIPBL-siRNA3的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；④ 陰性對照組：用攜帶陰性對照的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；⑤ 空白對照組：不添加慢病毒載體，其他操作步驟與前各組相同。設(shè)置MOI=60，轉(zhuǎn)染72 h后觀察結(jié)果。提取各組細(xì)胞RNA，通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后NIPBL基因的mRNA表達(dá)量，NIPBL、BMP-2、OCN、RUNX-2和內(nèi)參基因β-actin引物由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計(jì)與合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(20 μl)：cDNA 2 μl、上下游引物各1 μl、2×PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μl、ddH2O 6 μl。反應(yīng)條件：50 ℃、2 min，95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算NIPBL基因的mRNA相對表達(dá)量，確定各組的抑制效率，抑制效率=(空白組表達(dá)量-siRNA組表達(dá)量)/空白組表達(dá)量，選擇抑制效率最高的siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 NIPBL、β-actin、 BMP-2、 OCN 、RUNX-2引物信息

1.3.4轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力檢測 取三組細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)。在第1、3、5、7、9天的同一時(shí)間加入CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長吸光度值(optical density，OD)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.3.5誘導(dǎo)成骨分化 取三組細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，更換培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基(含基礎(chǔ)培養(yǎng)基175 ml、專用血清20 ml、雙抗2 ml、地塞米松20 μl、抗壞血酸400 μl、β-甘油磷酸鈉2 ml、谷氨酰胺2 ml)，每隔3 d更換培養(yǎng)基。

1.3.6檢測堿性磷酸酶活性 分別于成骨誘導(dǎo)的第5、7、10、14天收集細(xì)胞培上清液，按照說明書進(jìn)行檢測，使用酶標(biāo)儀測定520 nm波長OD值。

1.3.7qRT-PCR檢測BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA表達(dá)量 在成骨誘導(dǎo)的第7、14、21天，分別提取3組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，通過qRT-PCR檢測BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA表達(dá)量。反應(yīng)體系及條件同上文所述。采用2-ΔΔCt法計(jì)算BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA相對表達(dá)量。

1.3.8Western blot檢測OCN、BMP-2、RUNX-2基因的蛋白表達(dá)水平 在成骨誘導(dǎo)的第7、14、21天，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。加入5×buffer配平后煮沸變性進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜。使用雙蒸水浸泡3 min、1×電轉(zhuǎn)液浸泡12 min活化NC膜。室溫?fù)u床上封閉3 h，各自加入β-actin(1 ∶400)、Runx2(1 ∶2 000)、OCN(1 ∶2 000)、BMP2(1 ∶2 000)一抗，于4 ℃冰箱搖床孵育過夜。用TBST洗膜3次后，加入二抗(1 ∶20 000)室溫?fù)u床孵育2 h，用TBST洗膜3次后，加發(fā)光試劑(ECL)顯色后掃描，使用ImageJ軟件進(jìn)行分析灰度值，目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.3.9茜素紅染色分析 在成骨誘導(dǎo)21 d后，PBS沖洗2次，中性甲醛固定30 min，PBS沖洗2次，茜素紅染液染色5 min，PBS沖洗3次，倒置相差顯微鏡下觀察染色結(jié)果。再加入10%氯化十六烷基吡啶脫色30 min，每組取3個(gè)重復(fù)樣本，使用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長OD值。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果及抑制效率慢病毒轉(zhuǎn)染后，siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組和陰性對照組可見大量熒光，空白對照組無熒光(圖2)。siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組、陰性對照組、空白對照組NIPBL基因的mRNA相對表達(dá)量為(0.498±0.015)、(0.589±0.250)、(0.301±0.025)、(1.039±0.214)、(1.000±0.011)，陰性對照組與空白對照組的NIPBL基因的mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組的抑制效率分別為51%、42%、70%。NIPBL-siRNA3抑制效率最佳，用其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 倒置相差熒光顯微鏡下各組慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果 ×100A：siRNA1組；B：siRNA2組；C：siRNA3組；D：陰性對照組；E：空白對照組

2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力比較實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組及空白對照組在前5天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在第6天后，陰性對照組與空白對照組細(xì)胞增殖能力提高，實(shí)驗(yàn)組增殖能力增加緩慢，陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞的生長曲線

2.3 堿性磷酸酶活性比較隨著時(shí)間增加，各組細(xì)胞堿性磷酸酶活性均增加，實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶活性在第5天時(shí)與陰性對照組和空白對照組無差異，在6 d后各時(shí)間點(diǎn)較陰性對照組和空白對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對照組與空白對照組之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性與陰性對照組比較：*P<0.05；與空白對照比較：#P<0.05

2.4BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA表達(dá)量在第7、14及21天均低于陰性對照組和空白對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對照組和空白對照組在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量無差異。見圖5。

圖5 BMP-2、OCN、RUNX-2基因的mRNA表達(dá)量A: BMP-2基因; B：OCN基因；C：RUNX-2基因

2.5OCN、BMP-2、RUNX-2基因的蛋白表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組BMP-2、OCN、RUNX-2基因的蛋白表達(dá)量在第7、14及21天均低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對照組和空白組在各時(shí)間點(diǎn)，蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OCN基因的蛋白表達(dá)量在第7、14天無變化，第21天時(shí)表達(dá)量增加。BMP-2、RUNX-2基因的蛋白表達(dá)量均隨時(shí)間增加而增加，在第21天表達(dá)量最多。見圖6。

圖6 各組中OCN、BMP-2、RUNX-2基因的蛋白表達(dá)水平A:第7天；B:第14天；C:第21天；

2.6 茜素紅染色結(jié)果成骨誘導(dǎo)分化的第21天，按照說明書進(jìn)行茜紅素染色后觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組鈣結(jié)節(jié)低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)，陰性對照組和空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖7。

圖7 倒置相差顯微鏡下茜素紅染色結(jié)果 ×400A：實(shí)驗(yàn)組；B：陰性對照組；C：空白對照組

3 討論

CdLS作為一種遺傳異質(zhì)性疾病，具有廣泛的表型變異性，從輕度到重度具有不同程度的面部、肢體畸形。CdLS發(fā)病主要與粘蛋白復(fù)合體相關(guān)的基因突變有關(guān)，其中以NIPBL基因突變?yōu)橹?，且有研究[6]表明NIPBL基因突變所致CdLS患者有更嚴(yán)重的面部、肢體骨骼發(fā)育畸形。有研究[7]表明在S期、G1期和G2期，NIPBL基因參與調(diào)控將黏蛋白復(fù)合物加載到染色質(zhì)上的過程。因此NIPBL基因突變引起基因表達(dá)調(diào)節(jié)的異常從而導(dǎo)致CdLS的發(fā)生，目前公認(rèn)為NIPBL基因是CdLS的最重要的致病基因，但是其具體分子機(jī)制尚不明確,因此研究NIPBL基因?qū)Τ晒欠只恼{(diào)控機(jī)制具有重要意義。

慢病毒載體可以將外源基因有效的整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性的表達(dá)[8]。因此，該實(shí)驗(yàn)采取慢病毒載體將目的基因轉(zhuǎn)染到小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)通過慢病毒轉(zhuǎn)染抑制NIPBL基因表達(dá)，抑制效率達(dá)70%。通過CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力：空白對照組和陰性對照組的細(xì)胞增長曲線沒有明顯差異，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力降低。PCR檢測轉(zhuǎn)染后NIPBL基因表達(dá)情況：空白對照組與陰性對照組無明顯差異，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量約為空白對照組的30%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明慢病毒載體不會影響細(xì)胞生長，且能使目的基因有效表達(dá)。

堿性磷酸酶是早期反映細(xì)胞成骨分化水平的重要標(biāo)志物[9]。該實(shí)驗(yàn)在成骨誘導(dǎo)過程中，堿性磷酸酶活性隨著時(shí)間而逐漸增加，在第5天后，實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶活性明顯低于陰性對照組和空白對照組。RUNX-2是成骨誘導(dǎo)分化過程中關(guān)鍵的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，是骨形成的過程中較早和具有明顯特征性的標(biāo)志物之一[10]。OCN是成骨分化的特異性基因，形成骨基質(zhì)中的主要非膠原成分，調(diào)節(jié)控制礦物質(zhì)形成的方向和速度[11]。BMP-2是一種酸性糖蛋白，在調(diào)控骨形成發(fā)育中起著重要作用[12]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在成骨誘導(dǎo)的第7、14、21天，實(shí)驗(yàn)組BMP-2、OCN、RUNX-2的mRNA和蛋白表達(dá)量均低于陰性對照組和空白對照組，說明通過慢病毒轉(zhuǎn)染沉默NIPBL基因后，成骨相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制。茜素紅染色結(jié)果反映成骨分化晚期的鈣鹽沉積情況，該實(shí)驗(yàn)顯示在成骨誘導(dǎo)21天后實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和空白對照組均出現(xiàn)鈣鹽沉積，但實(shí)驗(yàn)組明顯少于空白對照組和陰性對照組。有研究[13]表明ALP、RUNX-2可反映早期的成骨狀態(tài)，BMP-2、OCN可以反映晚期的成骨狀態(tài)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組ALP、RUNX-2、BMP-2、OCN的表達(dá)均下降，表明NIPBL基因在調(diào)控成骨分化過程中發(fā)揮一定作用。

課題組前期研究[5]表明敲除NIPBL基因后Wnt5a基因的表達(dá)水平受到抑制，Wnt5a是Wnt信號通路的一個(gè)重要因子，且能與ROR蛋白結(jié)合，以調(diào)節(jié)成骨和軟骨的形成，從而調(diào)控肢體發(fā)育形態(tài)。Wnt/β-catenin信號通路在成骨過程中發(fā)揮作用，而OCN、RUNX-2是該信號通路的靶基因[14]。該研究顯示，用慢病毒沉默NIPBL基因后，小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力和成骨分化能力會減弱，其機(jī)制可能是通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控成骨的過程。由此推測CdLS患者的骨骼發(fā)育異?？赡芘cWnt信號通路的下調(diào)有關(guān)，其具體調(diào)控機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。