石琳琳, 楊燦燦, 陳 琪, 徐 軍, 張 平*,, 何 林*,

(1. 西南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400715；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，北京 100193)

丁氟螨酯 (CYF) 是一種使用廣泛的新型手性高效殺螨劑，可以有效防控紅蜘蛛的各個(gè)生長(zhǎng)階段，已在全世界范圍內(nèi)商業(yè)化并用于多種農(nóng)作物[1]。目前，關(guān)于丁氟螨酯的研究主要集中在土壤中的降解和代謝途徑以及對(duì)靶標(biāo)生物的毒理學(xué)方面[2]。研究表明，丁氟螨酯對(duì)環(huán)境存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性[2]，不合理使用會(huì)造成土壤中CYF 的沉積量不斷增加。農(nóng)藥對(duì)土壤環(huán)境影響的評(píng)估，主要通過其對(duì)土壤系統(tǒng)中微生物的影響以及對(duì)土壤中非靶標(biāo)生物的毒性等研究進(jìn)行。據(jù)報(bào)道，丁氟螨酯對(duì)映體會(huì)影響土壤微生物的結(jié)構(gòu)，甚至?xí)茐脑械耐寥赖h(huán)功能，最終對(duì)生態(tài)環(huán)境造成負(fù)面影響[3]。而丁氟螨酯在土壤中對(duì)非靶標(biāo)生物的毒理學(xué)研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

蚯蚓作為土壤中的主要非靶標(biāo)動(dòng)物對(duì)土壤富集營(yíng)養(yǎng)和有機(jī)物、無機(jī)物的分解有著極其重要的作用[4]，它可以分解土壤中死去的有機(jī)物，同時(shí)也是許多物種的重要食物來源[5]。由于蚯蚓對(duì)農(nóng)藥的刺激十分敏感，通常被作為土壤污染監(jiān)測(cè)最為敏感的生物標(biāo)志物[6]。鑒于此，本研究通過研究丁氟螨酯在蚯蚓體內(nèi)富集能力以及對(duì)其體重的影響，評(píng)估了丁氟螨酯的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，以期為全面評(píng)價(jià)新型乙腈類殺螨劑丁氟螨酯提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料與儀器

98%丁氟螨酯消旋體 (Rac-CYF) 購(gòu)于北京華威銳科公司，(?)-CYF 和 (+)-CYF 為本實(shí)驗(yàn)室分離得到，純度亦均為98%。分析純乙醇、正己烷、異丙醇、1%乙酸、丙酮、無水硫酸鈉和氯化鈉購(gòu)于Amida Chemical Co., Ltd；0.22 μm 濾膜購(gòu)于西南大學(xué)文化用品百貨公司。其他試劑均為分析純或色譜純。供試蚯蚓為赤子愛勝Eisenia fetida，購(gòu)于青島瓦力生物科技有限公司。供試前于 (20 ±2)℃、相對(duì)濕度80%條件下適應(yīng)環(huán)境2 周。挑選體重均勻[(0.4 ± 0.02) g]、帶有生殖環(huán)的蚯蚓，置于濾紙上進(jìn)行12 h 的清腸處理。試驗(yàn)用土為人工土，由70%沙土、20%高嶺土和10%泥炭蘚 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 組成，用碳酸鈣調(diào)節(jié)pH 值為6.0 ± 0.5，完全符合經(jīng)合組織 (OECD) 人工土配制標(biāo)準(zhǔn)[7]。

Shimadzu LC-20AD 正相液相色譜儀 (日本Shimadzu 公司)；高速組織搗碎機(jī) (上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；ZWY-240 恒溫培養(yǎng)振蕩器 (上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器公司)；3-5N 臺(tái)式低速離心機(jī) (湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 丁氟螨酯對(duì)映體在蚯蚓體內(nèi)富集情況檢測(cè)

向已配制好的人工土中添加CYF，添加水平為10 mg/kg 的CYF 消旋體，其兩個(gè)等量對(duì)映體均為5 mg/kg，將蚯蚓暴露于含藥土壤中。分別于處理后2、4、7、9、12、14 和21d 取樣檢測(cè)對(duì)映體在蚯蚓體內(nèi)富集情況。按公式 (1) 計(jì)算生物-土壤富集因子(BSAF)[8]。

式中，ce為蚯蚓體內(nèi)對(duì)映體濃度，單位 mg/kg；cs為土壤中對(duì)映體濃度，單位 mg/kg。

1.3 蚯蚓樣品中丁氟螨酯的提取及檢測(cè)

取染毒處理后的蚯蚓樣品5 g，過夜吐泥后，放入50 mL 離心管中，加入25 mL 乙腈，用高速組織搗碎機(jī)勻漿30 s；加入2 g 氯化鈉、2 g 硫酸鈉和10 mL 去離子水，于300 r/min 下振蕩30 min 后，于4500 r/min 下離心15 min；取上清液，過無水硫酸鈉后轉(zhuǎn)移至梨形蒸發(fā)瓶；反復(fù)提取3 次。收集全部提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL，加入1 mL 正己烷進(jìn)行分層萃取；同樣步驟進(jìn)行3 次。取上清液，于40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用正己烷定容至1 mL，過0.22 μm 濾膜，待NP-HPLC 測(cè)定。

檢測(cè)對(duì)映體拆分的手性分離柱選用AY-H柱，流動(dòng)相為V(正己烷) :V(異丙醇)=97 : 3 溶液，柱流量為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。每個(gè)樣品3 次重復(fù)。

1.4 添加回收試驗(yàn)

向蚯蚓空白樣品中添加0.5、5 和10 mg/kg 3 個(gè)水平的丁氟螨酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)5 次。采用1.3 節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，采用NPHPLC 系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。根據(jù)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)擬合效果、添加回收率、檢出限驗(yàn)證該方法的可行性[3]。

1.5 CYF 暴露后蚯蚓體重檢測(cè)

挑選體重為 (0.5 ± 0.1) g 的蚯蚓，分別放入CYF 質(zhì)量濃度為0.5、5 和10 mg/L 的人工土壤中，記錄各濃度暴露下蚯蚓的體重變化。選擇7條蚯蚓，記錄其初始體重 (W0)，分別在暴露4、7、14、21 和28 d 后記錄蚯蚓體重 (Wd)，根據(jù)公式 (2) 計(jì)算體重的變化率(R)。暴露結(jié)束后，用1 mm 網(wǎng)篩篩分各處理土壤，收集蚯蚓繭和蚯蚓幼體。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.6 急性毒性試驗(yàn)

分別采用濾紙法和人工土壤法兩種方法進(jìn)行。

1.6.1 濾紙法 根據(jù)OECD 標(biāo)準(zhǔn)[7]，在直徑3 cm、高8 cm 的圓底玻璃管中鋪好濾紙并確保沒有重疊，分別加入1 mL 用正己烷配制的質(zhì)量濃度為50、100、150、200、300、500、700 和1000 mg/L的丁氟螨酯消旋體和對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)溶液，待正己烷完全揮發(fā)后，用1 mL 無菌水均勻潤(rùn)濕濾紙，放入一條已清腸的蚯蚓，確保蚯蚓可以接觸到濕潤(rùn)的濾紙，每組10 次重復(fù)。以只加1 mL 正己烷和1 mL無菌水的處理為空白對(duì)照。將玻璃管封口并保持透氣，于18℃、相對(duì)濕度80%條件下培養(yǎng)48 h，觀察蚯蚓死亡情況。

根據(jù)Marking 相加指數(shù)法[8]，按公式 (3)～(5)評(píng)價(jià)兩個(gè)對(duì)映體對(duì)蚯蚓的聯(lián)合毒性。

式中，S為兩個(gè)對(duì)映體的相加毒性之和，An(Bn) 為消旋體的LC50值；Aj和Bj分別是單一對(duì)映體的LC50值；AI 為聯(lián)合毒性指數(shù)。

根據(jù)AI 值的大小判斷藥物的毒性類型：?0.2

1.6.2 人工土壤法 根據(jù)OECD 標(biāo)準(zhǔn)[7]，將500 g干燥人工土與丁氟螨酯標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，使丁氟螨酯在土壤中的最終質(zhì)量濃度分別為150、200、300、500、700 和1000 mg/L，保持持水量在40%，分裝于燒杯中，每個(gè)處理10 條蚯蚓，3 次重復(fù)。封口后于18℃、相對(duì)濕度80% 條件下培養(yǎng)14 d，觀察死亡情況。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 軟件單因素方差one-way ANOVA分析處理組和對(duì)照組之間的差異顯著性 (P<0.05)，用Origin 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表1 可知：在0.5、5 和10 mg/kg 3 個(gè)添加水平下，丁氟螨酯在蚯蚓中的回收率在84%～88%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 在1.3%～3.1%之間。各對(duì)映體的降解曲線符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程，線性擬合數(shù)據(jù)的R2均在0.97～0.98 之間。各對(duì)映體在蚯蚓中的定量限 (LOQ) 均為0.3 mg/kg。回收率及RSD 可滿足農(nóng)藥殘留分析的要求[3]，說明該提取方法適用于蚯蚓中丁氟螨酯的提取。

表1 丁氟螨酯對(duì)映體在蚯蚓中的添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recoveries and relative deviation detection of each enantiomer of cyflumetofen in earthworms

2.2 丁氟螨酯對(duì)映體在蚯蚓體內(nèi)的富集行為

結(jié)果 (圖1) 表明：隨著CYF 暴露時(shí)間的增加，各對(duì)映體在蚯蚓中的富集濃度均不斷增加。前4 d 蚯蚓富集 (?)-CYF 的能力較強(qiáng)，第7 天其濃度達(dá)到最高點(diǎn)；7 d 后，蚯蚓體內(nèi) (+)-CYF 的濃度一直高于 (?)-CYF。BSAF 值測(cè)定結(jié)果也表明，(+)-CYF 和 (?)-CYF 在生物-土壤富集過程中存在選擇性行為 (表2)。第7 天后， (+)-CYF 處理組的BSAF 值持續(xù)高于 (?)-CYF 處理組，表明蚯蚓富集 (+)-CYF 的能力更強(qiáng)。

表2 土壤中丁氟螨酯對(duì)映體 (5 mg/kg) 暴露不同時(shí)間后在蚯蚓體內(nèi)的BSAF 值Table 2 BSAF value of CYF enantiomers (5 mg/kg) in earthworms during the enrichment process

圖1 丁氟螨酯對(duì)映體經(jīng)土壤暴露后在蚯蚓體內(nèi)的富集曲線Fig. 1 Enrichment curve of CYF enantiomers in earthworms after exposure to soil

2.3 丁氟螨酯對(duì)蚯蚓體重的影響

經(jīng)丁氟螨酯系列梯度濃度處理后，蚯蚓體重較對(duì)照組均顯著減少，28 d 時(shí)高濃度處理組較低濃度處理組減重程度更大，表明存在劑量效應(yīng) (圖2)。經(jīng)過不同時(shí)間的監(jiān)測(cè)觀察，除14 d 時(shí)對(duì)照組中出現(xiàn)4 個(gè)蚯蚓繭外，其余各處理各個(gè)時(shí)間段均未發(fā)現(xiàn)蚯蚓繭和幼體。

圖2 經(jīng)不同濃度丁氟螨酯處理后蚯蚓體重的變化Fig. 2 Changes of the earthworm weight treated with different concentrations of CYF

2.4 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

丁氟螨酯消旋體及其對(duì)映體對(duì)蚯蚓的急性毒性結(jié)果如表3 所示。濾紙法中，CYF 消旋體對(duì)蚯蚓的LC50值低于各對(duì)映體的。根據(jù)聯(lián)合毒性分析，計(jì)算得到S值為1.03，AI 值為 ?0.03，介于?0.2

表3 丁氟螨酯消旋體及對(duì)映體對(duì)蚯蚓的急性毒性Table 3 Acute toxicity test results of the Rac-CYF and enantiomers to earthworms

3 結(jié)論與討論

丁氟螨酯因其卓越的殺螨效果而被廣泛使用，但近年來其對(duì)環(huán)境的影響已逐漸受到關(guān)注。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，丁氟螨酯對(duì)映體不僅在細(xì)胞層面對(duì)人的肝細(xì)胞具有毒性[2]，對(duì)斑馬魚胚胎具有選擇性毒性[9]，而且對(duì)環(huán)境微生態(tài)中的微生物種群和氮循環(huán)功能也會(huì)造成負(fù)面影響[3]。本研究以土壤生態(tài)系統(tǒng)中的非靶標(biāo)生物蚯蚓為對(duì)象進(jìn)行了毒理學(xué)研究。首先，成功建立了丁氟螨酯在蚯蚓體內(nèi)的檢測(cè)方法。手性農(nóng)藥在不同處理下的生物-土壤富集是具有對(duì)映體選擇性的，且其選擇性可能受不同暴露條件的影響 (如氟蟲腈)[10]。另外，通過比較BSAF 值也得到了 (+)-CYF 相比 (?)-CYF 在蚯蚓體內(nèi)富集能力更強(qiáng)的結(jié)論。說明手性農(nóng)藥不但在生物活性上表現(xiàn)出顯著性差異，而且其對(duì)映體在非靶標(biāo)蚯蚓中的富集能力也不一致。對(duì)暴露于不同濃度丁氟螨酯中的蚯蚓體重檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨濃度增加，蚯蚓減重程度更大，由此猜測(cè)施用手性殺螨劑丁氟螨酯會(huì)使蚯蚓體內(nèi)相關(guān)的代謝功能紊亂，可能抑制蚯蚓體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生成，進(jìn)而延緩蚯蚓的生長(zhǎng)發(fā)育。丁氟螨酯在蚯蚓體內(nèi)高濃度累積會(huì)造成其體重嚴(yán)重減少，而體重的減少可能與能量?jī)?chǔ)備的減少有關(guān)，包括糖原、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量的消耗[11]。根據(jù)丁氟螨酯對(duì)蚯蚓的急性毒性LC50值發(fā)現(xiàn)，單一使用一種丁氟螨酯對(duì)映體 (?)-CYF對(duì)蚯蚓的毒性會(huì)小于直接使用丁氟螨酯消旋體的毒性。因此，合理使用手性殺螨劑丁氟螨酯尤為重要。本研究中，通過對(duì)丁氟螨酯在非靶標(biāo)生物蚯蚓的有關(guān)急性毒性、生物-土壤富集以及體重方面進(jìn)行研究，為丁氟螨酯對(duì)映體的使用及相關(guān)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了理論依據(jù)。