張鴻超, 陳德勇, 韓 瑩, 陳捷胤,戴小楓, 孔志強*,, 顏廷才

(1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學 食品學院，沈陽 110866；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，北京 100193；3. 塔里木大學 生命科學學院，新疆維吾爾自治區(qū) 阿拉爾 843300)

黃瓜種植過程易發(fā)生病蟲害，目前主要通過化學農(nóng)藥進行防治，但由于連續(xù)大量使用化學農(nóng)藥，使得病蟲害的抗藥性增加，農(nóng)藥使用量進一步加大，且因黃瓜果實成熟期短和安全間隔期不足，導致黃瓜中農(nóng)藥殘留甚至超標風險升高[1-2]。

目前，國內(nèi)登記用于黃瓜病蟲害防治的藥劑多達幾百種，但在黃瓜種植過程中仍然存在使用未登記農(nóng)藥的現(xiàn)象，如以調(diào)節(jié)植物生長的多效唑、防治黃瓜紅蜘蛛的丁氟螨酯以及防治黃瓜赤霉病的丙硫菌唑為代表的農(nóng)藥殘留處于監(jiān)管盲區(qū)，導致其使用存在安全隱患。此外，噴施到植物上的農(nóng)藥母體有10%～20% 轉(zhuǎn)化為其代謝產(chǎn)物[3]，這些代謝物表現(xiàn)出的遷移性、持久性及毒性等各不相同[4]。如丁氟螨酯在環(huán)境中會轉(zhuǎn)化成復雜的代謝產(chǎn)物，主要代謝產(chǎn)物中B-3 對哺乳動物毒性大，難降解，對環(huán)境和人類都有潛在的風險[5]。

目前，關(guān)于黃瓜中農(nóng)藥檢測方法主要有液相色譜 (LC)[6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLCMS/MS)[7-8]、氣相色譜 (GC)[9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (GC-MS/MS)[10]等，但同時檢測黃瓜中多效唑、戊唑醇、丙硫菌唑等6 種農(nóng)藥及3 種代謝物(丁氟螨酯代謝物B-3、三唑酮代謝物三唑醇、苯醚甲環(huán)唑代謝物CGA205375) 殘留的分析方法尚未見報道，且目前已有的結(jié)果大多是在單次直接施用農(nóng)藥后進行試驗獲得的，而在實際設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，農(nóng)藥常為多次頻繁使用，不斷累積造成了農(nóng)藥的 “持久” 殘留[11]。因此，本研究選擇設(shè)施蔬菜-黃瓜中常用的6 種農(nóng)藥，參照其在設(shè)施蔬菜生產(chǎn)過程中的施藥劑量與殘留水平，設(shè)置了推薦劑量和極端施藥劑量 (5 倍推薦劑量) 兩種劑量，通過QuEChERS 前處理方法，采用UPLCMS/MS 法測定其在黃瓜中的消解動態(tài)及代謝規(guī)律，以期為其在黃瓜上的科學施用提供理論依據(jù)并指導實際生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC 液相色譜儀， Xevo TQ-S micro Triple Quadrupole Mass Spectrometry 質(zhì)譜儀和MassLynx 工作軟件，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (美國Waters 公司)；十萬分之一天平 (瑞士Mettler Toledo 公司)；渦旋混勻器(Scientific Industries 公司)；Centrifuge 5424 高速冷凍離心機 (德國 eppendorf 公司)；VX-Ⅲ 多管渦旋振蕩器 (北京安簡科技有限公司)；EVAPTM111 氮吹儀 (美國OA 公司)；Cleanert MAS-Q 2 mL Centrifuge Tube 固相萃取填料 (天津博納艾杰爾公司)。

標準品：丙硫菌唑 (prothioconazole)、丁氟螨酯代謝物B-3[(2-(trifluoromethyl) benzamide)]、丁氟螨酯 (cyflumetofen)、苯醚甲環(huán)唑 (difenoconazole)、三唑酮 (triadimefon)、戊唑醇 (tebuconazole)、多效唑 (paclobutrazol)、苯醚甲環(huán)唑代謝物CGA205375(difenoconazole-alcohol)、三唑酮代謝物三唑醇 (triadimenol)，質(zhì)量濃度均為1000 μg/mL，購于天津阿爾塔科技有限公司。田間試驗藥劑信息見表1。乙腈 (色譜級，99.0%)， 購自Macklin 公司 (中國)，甲酸 (色譜級) ，購自賽默飛世爾科技 (中國) 有限公司；氯化鈉、無水硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽由國藥化學試劑有限公司 (中國上海) 提供。

表1 6 種田間試驗藥劑信息Table 1 Commercial information of 6 pesticides

1.2 田間試驗與取樣

田間試驗根據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[12]于2020 年5 月在北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)趙前旗蔬菜大棚進行，共劃分為3 個試驗小區(qū)，分別設(shè)5 倍推薦劑量和推薦劑量及空白對照組，每個小區(qū)面積為16 m2，小區(qū)間設(shè)1 m 寬的保護行。于黃瓜植株掛果期施藥1 次，采取噴霧方式分別施用推薦劑量和5 倍推薦劑量的混合農(nóng)藥，分別于施藥后2 h 及1、3、5、7、10、14、21 d，采收成熟健康可食用果實，于 ?20 ℃下保存，待測。

1.3 樣品前處理

稱取10 g (精確至0.1 g) 均質(zhì)后的黃瓜樣品于50 mL 聚乙烯離心管中，加入1.0 g 的L-半胱氨酸鹽酸鹽與10.0 mL 乙腈提取，高速渦旋振蕩勻漿5.0 min 后，加入6 g 硫酸鎂與1.5 g 氯化鈉，高速渦旋振蕩1.0 min 后，于4000 r/min 下離心5.0 min；準確吸取1.5 mL 上清液，加入裝有Cleanert MASQ 2mL Centrifuge Tube (150 mg MgSO4，50 mg PSA，15 mg GCB) 固相萃取填料的試管中，高速渦旋振蕩30 s，于8000 r/min 下離心5.0 min；取上清液，過0.22 μm 有機濾膜，供UPLC-MS/MS分析。

1.4 標準溶液配制

混合標準儲備液 (用作添加回收、校準和對照溶液)：9 種目標化合物標準品溶液 (1000 μg/mL)各取1 mL 置于10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，配成100 μg/mL 的農(nóng)藥混合標準儲備液，于 ?20 ℃保存，備用。

混合標準工作溶液 (用于繪制溶劑標準曲線)：用乙腈稀釋上述混合標準儲備液，配制成質(zhì)量濃度在0.001～0.8 μg/mL 之間的系列混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

基質(zhì)匹配混合標準工作溶液 (用于繪制基質(zhì)匹配標準曲線和計算添加回收率)：取空白黃瓜樣品，按1.3 節(jié)中前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋上述混合標準工作溶液，配制成0.001～0.8 μg/mL 的基質(zhì)匹配混合標準工作溶液。

1.5 儀器檢測條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm)；柱溫40 ℃；樣品室溫度4 ℃；流動相及梯度洗脫條件見表2，流動相A 相為體積分數(shù)0.1%的甲酸水，B 相為乙腈；進樣量5 μL；流速0.5 mL/min。

表2 流動相及洗脫梯度Table 2 Mobile phase and elution gradient

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描 (ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測模式。毛細管電壓2.20 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；錐孔氣流量150 L/h；脫溶劑氣流量1000 L/h；碰撞氣體壓力270 kPa。詳細質(zhì)譜離子參數(shù)見表3。

表3 6 種農(nóng)藥及3 種代謝物質(zhì)譜參數(shù)Table 3 Mass spectrometry parameters of 6 pesticides and their 3 metabolites

1.6 數(shù)據(jù)處理

參照文獻[13]，利用SigmaPlot version 12.0(Systat Software Inc. Point Richmond，CA) 一級動力學方程擬合農(nóng)藥在黃瓜中的消解趨勢。

基質(zhì)效應(yīng)的存在會影響方法的準確性和靈敏度。評價凈化劑的凈化效果時，應(yīng)考慮分析方法的基質(zhì)效應(yīng) (Me)，基質(zhì)效應(yīng)的計算公式見式 (1)。

式中，km為基質(zhì)匹配標準曲線的斜率，ks為溶劑標準曲線的斜率。當Me在80%～120%之間時，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略；當Me>120%時為基質(zhì)增強效應(yīng)；當Me<80%時為基質(zhì)減弱效應(yīng)[14]。

1.7 添加回收試驗

稱取10.0 g (精確至0.1 g) 空白黃瓜樣品于離心管中，分別添加0.001、0.01、0.05、0.1 和0.5 mg/kg 的農(nóng)藥混合標準溶液，每個水平重復5 次，按1.4 節(jié)及1.5 節(jié)的方法進行前處理及測定，計算平均回收率及相對標準偏差 (RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法驗證

根據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[12]要求，通過線性、回收率、相對標準偏差、檢出限(LOD) 和定量限 (LOQ) 等參數(shù)驗證方法是否滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。結(jié)果表明：按1.5 節(jié)的條件測定，該方法實現(xiàn)了黃瓜基質(zhì)中9 種分析物較好的分離，無干擾峰 (圖1)。在0.001～0.8 μg/mL 之間，9 種分析物的線性方程決定系數(shù) (R2)均大于0.99，表明該方程線性關(guān)系良好。以10 倍信噪比對應(yīng)的添加水平作為定量限 (LOQ)，則9 種分析物的LOQ 在0.001～0.01 mg/kg 之間 (表4)。

表4 9 種分析物在黃瓜中的線性方程、決定系數(shù)、回收率、基質(zhì)效應(yīng)及定量限Table 4 Linear equation, R2, recovery, matrix effect and LOQ of 9 analytes in cucumber

續(xù)表4Table 4 (Continued)

圖1 9 種分析物總離子色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms of 9 analytes

Me在87.00%～102.55%之間，表明不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)[14]。故本研究采用溶劑標準曲線或黃瓜基質(zhì)匹配標準曲線進行定量分析均可。

9 種分析物在黃瓜中的平均回收率在71%～105%之間，RSD 在1.7%～8.8%之間，小于20%，可滿足農(nóng)藥殘留檢測要求[12]。

2.2 6 種農(nóng)藥在黃瓜中的消解動態(tài)

本研究中農(nóng)藥殘留量是指使用農(nóng)藥后，殘存在黃瓜果實中的農(nóng)藥母體或代謝物的量。除丙硫菌唑外，其余5 種農(nóng)藥 (多效唑、三唑酮、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、丁氟螨酯) 在黃瓜中的消解動態(tài)均符合一級反應(yīng)動力學方程。按照表1 推薦劑量和5 倍推薦劑量施用，2 h 后黃瓜樣品中5 種農(nóng)藥的殘留量分別為0.0064～0.021、0.73～3.7、0.49～2.1、2.7～12 及0.12～0.68 mg/kg，5 種農(nóng)藥在黃瓜中的殘留量均與施藥時間成指數(shù)關(guān)系，可用一級反應(yīng)動力學方程進行擬合，其消解動態(tài)曲線見圖2。由表5 可知，5 種農(nóng)藥在黃瓜中的半衰期在3.15～9.62 d 之間，均屬于易降解農(nóng)藥 (< 30 d)。多效唑在黃瓜中的半衰期為4.31～7.15 d，其5 倍推薦劑量下的半衰期與推薦劑量下的相差最大，延長2.84 d，施藥后 5～7 d 消解率達到85%，21 d后未檢出，與楊銳[15]關(guān)于多效唑在番茄中的殘留研究結(jié)果相吻合。三唑酮在黃瓜中的半衰期為3.15～5.21 d，施藥后7～10 d 消解率為 95%，與前人[16-17]的研究結(jié)果相吻合。戊唑醇在黃瓜中的半衰期為3.35～4.62 d，施藥后7～10 d 消解率為 95%，與李洪等[18]的研究結(jié)果一致。苯醚甲環(huán)唑在黃瓜中的半衰期為4.29～4.66 d，5～7 d 消解率為 90%，施藥后 21 d 未檢出，與周松等[16]關(guān)于其在草莓果實中半衰期4.09 d 的結(jié)果相符。丁氟螨酯在黃瓜中的半衰期為6.90～9.62 d，10～14 d 消解率為80%，21 d 后未檢出，與李敏敏等[19]關(guān)于丁氟螨酯在土壤中的半衰期大于10 d 相比，存在一定的差距，這可能是因為丁氟螨酯的消解與有氧和厭氧環(huán)境、光解作用的影響有關(guān)。從總體數(shù)據(jù)看，在極端施藥 (5 倍推薦劑量) 條件下，除丙硫菌唑外，其余5 種農(nóng)藥的半衰期都比推薦劑量下有不同程度延長。農(nóng)藥的降解與農(nóng)藥性質(zhì)、初始濃度、環(huán)境pH 值、溫濕度、作物栽培條件及作物生長狀況等因素有關(guān)，在不同條件下，半衰期有不同程度的變化。吳祥為[20]的研究表明，農(nóng)藥的半衰期與其使用劑量和施藥頻次相關(guān)，高劑量施用會明顯抑制農(nóng)藥的降解并導致半衰期延長。三唑酮、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑均屬于內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，其揮發(fā)性、極性、空氣-水分配系數(shù)、辛醇-水分配系數(shù)各不相同。丙硫菌唑按推薦劑量施藥后殘留量低于LOQ，在5 倍推薦劑量下，2 h 的殘留量為0.053 mg/kg，1 d 后低于LOQ，這可能是因為丙硫菌唑的消解速率非?？?，極容易被氧化，更容易受環(huán)境因素的影響[20-21]。

表5 5 種農(nóng)藥在黃瓜中的消解動力學方程、半衰期及決定系數(shù)Table 5 Dissipation kinetic equation, dissipation rate constant, half-life,and determination coefficient of 5 pesticides in cucumber

圖2 5 種農(nóng)藥在黃瓜中的消解動態(tài)Fig. 2 Dissipation dynamics of 5 pesticides in cucumber

2.3 代謝物消解動態(tài)

圖3 為丁氟螨酯、苯醚甲環(huán)唑、三唑酮3 種母體對應(yīng)代謝物的消解動態(tài)。推薦劑量下，丁氟螨酯代謝物B-3 在施藥后5 d 達到最大值 (0.0047 mg/kg) ；5 倍推薦劑量下，施藥后3 d 達到最大值(0.0081 mg/kg)，21 d 時依然能檢測到B-3 殘留，與Wang 等[21]的研究結(jié)果趨勢一致，說明丁氟螨酯代謝物性質(zhì)較穩(wěn)定，在不同生態(tài)環(huán)境條件下殘留差異不明顯。由于B-3 的毒性大于母體化合物[21]，殘留時間比母體化合物長，因此在農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測分析中其代謝物的殘留分析不容忽視。與B-3 的趨勢相同，在推薦劑量下，三唑酮代謝物三唑醇在施藥后5 d 達到最大值 (0.044 mg/kg)；5 倍推薦劑量下，在施藥后3 d 達到最大值 (0.12 mg/kg)，但在14 d 后沒有檢測到其殘留，可能是因為三唑酮的原始沉積量相對較少，與蘭騰芳等[22]關(guān)于三唑酮在小麥和土壤中消解動態(tài)的研究結(jié)果相似。苯醚甲環(huán)唑代謝物CGA205375 在推薦劑量下于施藥后3 d 達到最大值 (0.034 mg/kg)；5 倍推薦劑量下同樣在施藥后3 d 達到最大值(0.051 mg/kg)，在10 d 后未檢測到其殘留。CGA205375 在黃瓜中消解速率較快，可能是因為植物細胞自身代謝較強和在大氣中易光解所致。

圖3 B-3，CGA205375 和三唑醇在黃瓜中的殘留消解動態(tài)Fig. 3 Residual dissipation dynamics of B-3, CGA205375 and triadi menol in cucumber

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-MS/MS 技術(shù)，通過田間試驗對黃瓜中6 種常用農(nóng)藥 (多效唑、戊唑醇、丙硫菌唑、苯醚甲環(huán)唑、丁氟螨酯、三唑酮) 的消解動態(tài)進行了研究。結(jié)果表明，除丙硫菌唑外，其余5 種農(nóng)藥在黃瓜中的消解動態(tài)均符合一級反應(yīng)動力學方程，在極端施藥 (5 倍推薦劑量)條件下，5 種農(nóng)藥的半衰期均有不同程度延長。本研究同時針對CGA205375、B-3 和三唑醇3 種代謝物的殘留動態(tài)進行了研究。研究結(jié)果可為設(shè)施蔬菜的日常監(jiān)控及風險評估等提供數(shù)據(jù)支撐。