張志豪 李 竣 何志勇 石召華 黃先菊

1.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與實(shí)驗(yàn)室管理中心，湖北 武漢 430074；3.武漢愛民制藥股份有限公司，湖北 鄂州 436070

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性代謝性疾病，其并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者致死致殘的主要原因。過去人們對(duì)糖尿病的聚焦點(diǎn)主要在神經(jīng)損害、血管損害及腎損害，而肝臟作為調(diào)節(jié)血糖最重要的器官，是參與機(jī)體糖代謝的重要組織之一。由于肝臟代償功能較強(qiáng)且早期肝損傷不明顯等因素，糖尿病肝損傷不易引起人們的關(guān)注。近年來，隨著糖尿病發(fā)病率的急劇增高，糖尿病肝損傷的發(fā)病率也顯著增高[1-4]。糖代謝紊亂容易導(dǎo)致高血糖癥的發(fā)生，引起糖原在肝臟堆積并引發(fā)肝臟微血管病變，損傷肝功能，其中以非酒精性脂肪肝最為常見。

香連丸是治下痢的古代名方，可清熱燥濕，行氣止痛。中成藥香連丸為黃連和木香以相使配伍的關(guān)系組成，處方均為黃連(吳茱萸制)與木香4∶1，用于濕熱痢疾，里急后重，腹痛泄瀉，菌痢，腸炎[5]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，香連丸可治療胃潰瘍[6]、腹瀉[7]、潰瘍性結(jié)腸炎[8]、及細(xì)菌性感染[9]等。但未見其對(duì)糖尿病引起的肝臟損傷的保護(hù)作用的相關(guān)報(bào)道。本研究采用高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ一次性腹腔注射建立2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus T2DM)大鼠模型，探討香連丸對(duì)T2DM大鼠肝臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)Sprague-Dawley (SD)大鼠60只，體重160～180 g，購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK-(遼)2015-0001。飼養(yǎng)于中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)飼料(武漢萬千佳興生物科技有限公司)；動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)過程符合美國國立衛(wèi)生院(NIH)準(zhǔn)則，并經(jīng)中南民族大學(xué)倫理委員會(huì)(編號(hào)：SYXK2016-0089)批準(zhǔn)[10]。實(shí)驗(yàn)溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，光照或者黑暗條件下讓老鼠自由進(jìn)食。為避免食物干擾，老鼠在實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。

1.1.2 藥物與試劑 香連丸(批號(hào)：20190404，湖北香連藥業(yè)有限責(zé)任公司)；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，批號(hào)：EZ2921B400，BioFroxx公司)；D12451高糖高脂飼料(批號(hào)：11126720000 33501，小黍有泰(北京)生物科技有限公司)；鹽酸二甲雙胍緩釋片(批號(hào)：20181026，武漢愛心康大藥房)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST，批號(hào)：140219005)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT，批號(hào)：140119007)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP，批號(hào)：1403190 05)、白蛋白(Albumin，ALB，批號(hào)：148319001)；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(Gamma glutamyltransferase，γ-GT，批號(hào)：141519008)；尿酸(Uric acid，UA，批號(hào)：141219004)；尿素(Urea，UREA，批號(hào)：141319002)；總膽固醇(Total cholesterol，TC，批號(hào)：141618014)；甘油三酯(Triglyceride，TG，批號(hào)：141719003)測定試劑盒均為武漢嘉晟瑞康科技有限公司；Rat TNF-α ELISA Kit試劑盒(批號(hào)：080620190709，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Rat IL-6 ELISA Kit試劑盒(批號(hào)：20191011，武漢安特捷生物科技有限公司)；大鼠總超氧化物歧化酶(T-SOD)ELISA試劑盒(批號(hào)：MM-0731 R1，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)；丙二醛(MDA)測試盒(批號(hào)：01910170，北京邁瑞達(dá)科技有限公司)；檸檬酸鈉及檸檬酸、無水葡萄糖、烏拉坦(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 動(dòng)物的造模、分組及給藥 60只大鼠隨機(jī)分出8只作為正常對(duì)照組，喂養(yǎng)普通飼料；其余52只大鼠喂養(yǎng)高脂飼料4周，然后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素40 mg/kg，建立T2DM模型。正常組給予等體積枸櫞酸緩沖液，1周后檢測大鼠空腹血糖(Fasting billd glucose，F(xiàn)BG)，血糖濃度高于11.1 mmol/L的大鼠視為造模成功，確認(rèn)糖尿病模型32只。將糖尿病成模的大鼠隨機(jī)分為4組，分別為模型對(duì)照組、陽性對(duì)照二甲雙胍組[11-12]、香連丸低劑量組和香連丸高劑量組，每組8只，正常組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水，二甲雙胍組大鼠給予140 mg/kg二甲雙胍，香連丸治療組分別給予150 mg/kg和300 mg/kg香連丸灌胃，1次/d，共6周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般情況 動(dòng)物每周稱重，密切觀察動(dòng)物精神狀態(tài)、反應(yīng)性、毛發(fā)色澤、飲食及排泄?fàn)顩r。稱重，記錄體重以及死亡情況。

1.3.2 空腹血糖和口服糖耐量(OGTT)實(shí)驗(yàn) 各組大鼠灌胃給予香連丸治療6周后進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，尾靜脈取血病檢測空腹血糖水平，然后每只大鼠灌胃給予葡萄糖溶液2.5 g/kg，分別在給予葡萄糖后30，60，120 min采血，并測定血糖值(三諾安穩(wěn)血糖儀及試紙條)，計(jì)算血糖曲線下面積(AUC)。血糖AUC=1/4×BG(0 min)+1/2×BG(30 min)+3/4×BG(60 min)+1/2×BG(120 min)。

1.3.3 血清中相關(guān)生化指標(biāo)檢測 末次灌胃給藥后，大鼠禁食12 h，采用烏拉坦(100 mg/kg)進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，離心并分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，Mindray BS-240VET型)檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)、白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、尿素(UREA)。試劑盒檢測總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)。

1.3.4 TNF-α，IL-6含量檢測 采用ELISA法檢測大鼠血清TNF-α，IL-6含量。嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常組大鼠健康狀態(tài)良好，進(jìn)食、飲水均正常，糞便成形，毛色光澤；模型組大鼠進(jìn)食量增加、飲水增加、尿量增多、活動(dòng)減少、精神萎靡，被毛蓬松無光澤；相較于模型組，二甲雙胍組和香連丸低、高劑量組有明顯改善。給予受試體樣品干預(yù)期間，每周對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的體重進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠體重水平極顯著性下降(P<0.01)；與模型組大鼠體重比較，二甲雙胍組和香連丸低、高劑量組沒有顯著性差異。在整個(gè)治療期間，正常組、模型組、二甲雙胍組、香連丸低、高劑量組沒有死亡。

表1 香連丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體重的影響

2.2 香連丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠空腹血糖的影響 給予受試體樣品干預(yù)期間，每周對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的空腹血糖值進(jìn)行測定，與正常組大鼠比較，模型組大鼠空腹血糖水平極顯著性升高(P<0.01)。給予受試樣品4周后，與模型組大鼠空腹血糖比較，二甲雙胍組大鼠空腹血糖水平顯著性下降(P<0.05)。見表2。

表2 香連丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠空腹血糖的影響

2.3 香連丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠糖耐量的影響 正常組、模型組、二甲雙胍組以及香連丸低、高劑量組在葡萄糖灌胃后的60 min血糖達(dá)峰值，在接下來的60 min內(nèi)，正常組血糖逐漸下降，在灌胃120 min后基本恢復(fù)到正常血糖值；而模型組血糖值緩慢下降，其血糖水平與正常組、二甲雙胍組以及香連丸給藥低、高劑量組相比較一直維持在較高水平。與正常組比較，模型組血糖曲線下面積(AUC)極顯著性升高(P<0.01)。與模型組比較，香連丸高劑量組AUC顯著性下降(P<0.05)。二甲雙胍組、香連丸低劑量組AUC雖然低于模型組，但是無顯著性差異。以上結(jié)果表明：模型組大鼠對(duì)葡萄糖耐受力下降，出現(xiàn)胰島素抵抗，但是香連丸高劑量組可提高機(jī)體對(duì)葡萄糖的耐受量，改善胰島素抵抗。見表3。

表3 各組大鼠糖耐量及AUC水平

2.4 對(duì)肝腎功能和血脂的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、UREA、TC、TG水平極顯著性升高(P<0.01)，模型組大鼠血清中ALB-Ⅱ水平極顯著性降低(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、UA水平極顯著性降低(P<0.01)，二甲雙胍組大鼠血清中ALB-Ⅱ水平顯著性升高(P<0.05)；香連丸低、高劑量組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT水平極顯著性降低(P<0.01)，香連丸高劑量組大鼠血清中UA水平極顯著性降低(P<0.01)，香連丸低、高劑量組大鼠血清中ALP、TC、TG水平顯著性降低(P<0.05)，香連丸低、高劑量組大鼠血清中ALB-Ⅱ水平顯著性升高(P<0.05)，香連丸低劑量組大鼠血清中UA水平顯著性降低(P<0.05)。見表4、表5。

表4 香連丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝腎功能的影響

表5 香連丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血脂的影響

2.5 對(duì)T-SOD、MDA水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中的T-SOD水平極顯著性降低(P<0.01)，模型組大鼠血清中MDA水平極顯著性升高(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組T-SOD水平顯著性升高(P<0.05)，香連丸低、高劑量組極顯著性升高(P<0.01)，二甲雙胍組、香連丸低、高劑量組大鼠血清中MDA水平極顯著性降低(P<0.01)。見表6。

表6 香連丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清中T-SOD、MDA的影響

2.6 對(duì)TNF-α、IL-6水平的影響 連續(xù)6周灌胃給藥后發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清TNF-α的水平明顯升高。與正常組比較，模型組大鼠血清中的IL-6、TNF-α水平極顯著性升高(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組IL-6水平極顯著性降低(P<0.01)，二甲雙胍組TNF-α水平顯著性降低(P<0.05)。見表7。

表7 香連丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清中TNF-α、IL-6的影響

3 討論

肝臟是調(diào)節(jié)糖代謝的重要器官，肝損傷是常見的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，糖尿病合并肝損傷時(shí)肝臟糖代謝出現(xiàn)紊亂，使血糖進(jìn)一步升高，形成惡性循環(huán)[13]。高血糖會(huì)增加自由基的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而引發(fā)肝臟損傷和碳水化合物代謝紊亂[14-15]。目前對(duì)糖尿病的治療主要是以控制血糖、糾正糖代謝紊亂，減少及預(yù)防并發(fā)癥為主[16]。

實(shí)驗(yàn)通過高脂飼料聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射的方法誘導(dǎo)制備T2DM大鼠模型。高脂飲食使大鼠體內(nèi)產(chǎn)生胰島素抵抗，再通過小劑量STZ腹腔注射破環(huán)部分胰島β細(xì)胞，使其體內(nèi)胰島素分泌相對(duì)不足，造成T2DM大鼠模型。實(shí)驗(yàn)中大鼠出現(xiàn)多尿、多飲、多食及體重下降等臨床表現(xiàn)。研究結(jié)果顯示：香連丸可明顯降低高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠空腹血糖，改善糖耐量，顯示出良好的治療效果。

T2DM大鼠伴有肝功能異常主要表現(xiàn)為ALT、AST、ALP明顯升高[17]，SD大鼠造模后，與正常組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP水平極顯著性升高，說明大鼠肝細(xì)胞受損嚴(yán)重。經(jīng)過6周的治療后，二甲雙胍組和香連丸低、高劑量組大鼠血清AST、ALT、ALP水平有不同程度的下降。研究結(jié)果顯示：香連丸對(duì)T2DM大鼠早期肝損傷具有保護(hù)作用。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT和AST從胞漿釋放入血，血清中這兩種酶的活性在短時(shí)間內(nèi)升高，由此判斷肝細(xì)胞損傷程度[18]。

MDA水平可直接反映機(jī)體細(xì)胞自由基損傷程度。SOD是機(jī)體內(nèi)對(duì)抗氧化自由基重要蛋白酶，在清除超氧陰離子以及調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化與抗氧化平衡方面起著主要作用，是機(jī)體內(nèi)抗氧化與抗氧化平衡方面起著關(guān)鍵性的作用[19]。胡愛明等[20]采用小劑量STZ建立糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血液和肝組織MDA明顯增高，SOD等抗氧化酶的活性卻降低，證實(shí)糖尿病肝組織也存在著明顯的氧化應(yīng)激，這些氧化應(yīng)激導(dǎo)致組織和細(xì)胞的損傷。經(jīng)過6周的治療后，二甲雙胍組和香連丸低、高劑量組大鼠血清MDA水平有不同程度的下降，T-SOD水平均高于模型組。結(jié)果顯示：模型組大鼠血液的MDA明顯增高，T-SOD抗氧化酶的活性卻降低，說明香連丸可能通過抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)進(jìn)而減輕糖尿病肝損傷。

炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6水平的升高與糖尿病嚴(yán)重程度有關(guān)[21]，減輕炎癥可以改善胰島素抵抗。研究結(jié)果顯示：模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平升高，二甲雙胍組和香連丸低、高劑量組大鼠血清炎癥因子有不同程度的下降，表明香連丸可通過抑制炎癥反應(yīng)來保護(hù)受損肝細(xì)胞。

綜上所述，香連丸能夠降低血糖，改善糖耐量，同時(shí)也能夠調(diào)節(jié)血脂的TC和TG，以及增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，對(duì)糖尿病早期肝損傷具有一定的保護(hù)作用。