周春權(quán) 趙 立 蔣 暢 胡 娟，2*

1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州 350003;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122

中醫(yī)認(rèn)為，汗是人體內(nèi)的津液受到陽氣的蒸騰氣化作用而從汗孔排出來的水液。在炎熱的天氣、室內(nèi)溫度過高、衣褥過厚或者精神緊張等情況下常常出現(xiàn)生理性多汗。如果出汗的部位、出汗量的多少、以及汗液的顏色和汗液的氣味發(fā)生改變，可以通過這些來判斷身體可能患的一些疾病。汗液生成與排泄的異常將導(dǎo)致多種汗證[1-2]。自汗是由于人體陰陽失衡，腠理不固，而引起人體津液外泄失常所產(chǎn)生的病證。

太子參復(fù)方[3]以福建道地藥材太子參、藍(lán)花參為原料。太子參具有益氣補(bǔ)脾和生津潤肺的功效；藍(lán)花參具有補(bǔ)虛健脾，補(bǔ)虛損，止自汗、盜汗，除虛熱，止咳化痰等功效。在中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論的指導(dǎo)下，合理組方；二者配伍共奏益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)虛健脾，具有治療脾虛自汗之功效。本文通過建立脾虛自汗大鼠模型，觀察太子參復(fù)方對(duì)脾虛自汗大鼠的止汗作用以及探討其止汗的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半,體質(zhì)量(180±20)g，上海伊萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：Scxk(瀘)2017-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 和田-高垣氏試劑A、B(A液：碘濃度為2%無水乙醇溶液；B液：稱取可溶性淀粉50 g，加入100 mL花生油中混勻)，硝酸毛果蕓香堿(國藥準(zhǔn)字 H42021102，批號(hào)：13110401，武漢五景藥業(yè)有限公司)；利血平注射液(國藥準(zhǔn)字 H12020905，批號(hào)：1210111，天津金耀氨基酸有限公司)； AchR抗體(Cell Signaling)、β-Actin抗體(Cell Signaling)、二抗(SAB))均購自CWbio.Co.Ltd公司。

1.3 儀器 電子天平(德國Sartorius)，脫色搖床(海門其林貝爾)，電泳儀(北京六一儀器廠)，垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印模塊(美國Bio-Rad),高速離心機(jī)(Thermo)，NanoDrop 2000型分光光度計(jì)(Therno scientific)，7500熒光定量PCR儀(ABI)。

1.4 藥物 太子參復(fù)方，本實(shí)驗(yàn)室自制，按專利[3]進(jìn)行制備。全腦組織：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠處死，在冰面上迅速取出全腦，分裝于EP管內(nèi)，-80 ℃保存，備用。

2 方法

2.1 止汗作用實(shí)驗(yàn)

2.1.1 脾虛自汗大鼠模型的建立[4]采用利血平所致脾虛大鼠的方法建立模型，動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按體重隨機(jī)分成5組，即：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，太子參復(fù)方高、中、低組。除正常對(duì)照組外，其余各組每天上午，以利血平0.5 mg·kg-1腹腔注射，連續(xù)14 d，制備脾虛型大鼠，并觀察動(dòng)物行為。

2.1.2 給藥與實(shí)驗(yàn) 給藥組于造模的第8天開始，每天下午灌胃給藥，正常對(duì)照組和利血平組給等體積的蒸餾水，太子參復(fù)方高、中、低組(2.4、1.2、0.6 g·kg-1)，分別按成人臨床推薦劑量的5倍、10倍、20倍灌胃，連續(xù)給藥14 d。分別在開始給藥的第1、7、14天，末次給藥后45 min皮下注射毛果蕓香堿液35 mg·kg-1(正常組注射生理鹽水)，15 min將動(dòng)物轉(zhuǎn)入固定器內(nèi)，右后足固定籠外，適應(yīng)15 min，用棉簽蘸上無水乙醇輕輕將足跖部污物擦拭干凈，于大鼠足跖部皮膚涂上和田-高恒氏試劑A液，待干燥后，再薄薄涂上B液，然后于15 min后用10倍放大鏡計(jì)數(shù)深紫色著色點(diǎn)(即汗點(diǎn))的數(shù)目。

2.2 Western Blot法檢測乙酰膽堿受體的表達(dá)量實(shí)驗(yàn) 將腦組織剪切成小塊，稱重，按每20 mg組織加400 μL的比例加入裂解液，提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量，取相同質(zhì)量蛋白變性上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。封閉液封閉 2 h后置于一抗稀釋液[AchR(1∶300)，β-actin(1∶1 000)]4 ℃過夜。次日洗膜，加入二抗稀釋液[SAB(1∶3000)]孵育 1 h，用化學(xué)發(fā)光法于暗室中曝光、顯影、定影。凝膠成像儀攝像后用image J軟件分析灰度值。

2.3 RT-PCR法檢測乙酰膽堿受體mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 引物設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)采用的AchR基因及內(nèi)參基因的引物序列。見表1。

表1 引物序列表

2.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟 將腦組織剪切成小塊，稱重，用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA；取RNA進(jìn)行電泳，檢測RNA的完整性；用DNase Ⅰ試劑盒對(duì)RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理；用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2.3.3 Real-Time PCR進(jìn)行分析 用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

3 結(jié)果

3.1 太子參復(fù)方對(duì)脾虛自汗大鼠模型的影響 由表2可知，正常對(duì)照組與模型組比較，均有顯著性差異；而給藥組的高、中劑量組在第7天和第14天，止汗效果明顯，與模型組比較具有顯著性差異，低劑量組則差異不顯著。

表2 太子參復(fù)方對(duì)脾虛自汗大鼠模型的影響

3.2 太子參復(fù)方對(duì)脾虛大鼠體重的影響 由表3可知，實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重差異無顯著性，造模后，模型組及3個(gè)太子參復(fù)方劑量組大鼠體重增長幅度較正常對(duì)照組下降(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)后, 3個(gè)太子參復(fù)方劑量組大鼠的體重略高于模型組，說明本方具有一定健脾效果，但其與模型組之間的差異無顯著性，可能服藥時(shí)間較短，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長，健脾效果更顯著，對(duì)大鼠體重影響更大。

表3 太子參復(fù)方對(duì)脾虛大鼠體重的影響

3.3 太子參復(fù)方對(duì)脾虛自汗模型大鼠的AchR蛋白含量影響 經(jīng)過Western Blot 分析曝光及洗片后結(jié)果如圖1所示。

計(jì)算乙酰膽堿受體的相對(duì)灰度值，采用公式：乙酰膽堿受體的相對(duì)灰度值=乙酰膽堿受體灰度值/肌動(dòng)蛋白灰度值，計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 太子參復(fù)方中對(duì)脾虛自汗模型大鼠AChR蛋白表達(dá)灰度值的影響

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織AchR蛋白的表達(dá)明顯增加，不同劑量太子參復(fù)方能不同程度降低模型大鼠腦組織中AchR蛋白的表達(dá)，與模型組比較，太子參復(fù)方高、中劑量組AchR蛋白的表達(dá)明顯下降(P<0.01)。

3.4 RNA完整性及純度檢測 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28 s和18 s rRNA條帶清晰明亮，表明RNA完整性良好，微量紫外分光光度計(jì)測定RNA的吸光度，其OD260/280值均在1.8～2.1之間，表明RNA純度較高，無雜質(zhì)污染(圖2)。

3.5 Real-Time PCR檢測結(jié)果 各樣本目的基因和內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線和溶解曲線圖(圖3、圖4)顯示引物特異性良好。

3.6 相對(duì)定量分析結(jié)果 按照2-△△ct相對(duì)定量法，計(jì)算各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果，即各個(gè)樣品對(duì)于對(duì)照樣品，目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠AchR mRNA表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，各給藥組AchR mRNA表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示太子參復(fù)方能夠下調(diào)脾虛自汗大鼠大腦中AchR mRNA，表達(dá)結(jié)果如表5所示。

表5 太子參復(fù)方對(duì)脾虛自汗模型大鼠AchR mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

4 討論

利血平是屬于外圍交感神經(jīng)抑制藥或去甲腎上腺素能神經(jīng)末梢阻斷藥，利血平能夠抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)的功能，使得副交感神經(jīng)系統(tǒng)的功能就相對(duì)占優(yōu)，就會(huì)出現(xiàn)和中醫(yī)脾虛證有高度相似的癥狀，如鼻粘膜血管擴(kuò)張而鼻塞，消化功能亢進(jìn)而致大便次數(shù)增多、胃酸分泌增加、潰瘍病等。利血平可用于多種動(dòng)物制成脾虛模型,其表現(xiàn)的癥狀與人類最常見脾虛證型很相似。這種造模方法簡單易行,可靠性和重現(xiàn)性強(qiáng)。同時(shí)其發(fā)病機(jī)制有相當(dāng)一部分與膽堿能神經(jīng)功能亢進(jìn)、植物神經(jīng)功能紊亂有關(guān)。出汗是一種植物神經(jīng)調(diào)控性活動(dòng)，交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)是調(diào)節(jié)人體內(nèi)臟功能的神經(jīng)裝置，其功能為調(diào)節(jié)心肌、平滑肌和腺體(包括消化腺、汗腺、部分內(nèi)分泌腺)的活動(dòng)，一般汗腺由交感神經(jīng)支配。交感和副交感神經(jīng)節(jié)前纖維釋放的遞質(zhì)是乙酰膽堿。故神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的變化可能是調(diào)控機(jī)體汗腺出汗量的機(jī)理之一。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠在經(jīng)過注射利血平之后，出現(xiàn)了明顯的體重下降的情況，說明大鼠產(chǎn)生了脾虛的癥狀，脾虛后的大鼠在注射毛果蕓香堿液之后，汗液的量有明顯的增加，表明脾虛自汗模型大鼠的成功建立。本研究對(duì)太子參復(fù)方的止汗機(jī)制進(jìn)行了初步探討，實(shí)驗(yàn)中檢測到正常的大鼠也有微量的AchR mRNA 表達(dá)，刺激脾虛自汗模型造模后，大腦內(nèi)AchR表達(dá)顯著增高，說明脾虛自汗能激活A(yù)chR信號(hào)通路的活化，但是否直接激活，還有哪些參與作用的相關(guān)蛋白，有待下一步繼續(xù)研究。