張笑顏 薛璇璣 張新新 楊美娟 李鐵軍 郭增軍**

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，陜西 西安 710061；2.麟游縣衛(wèi)生健康局，陜西 寶雞 721599)

柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleuramscorzonerifoliumWilld.的干燥根，分別習(xí)稱為“北柴胡”和“南柴胡”，性辛、苦、微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有疏散退熱、疏肝解郁的功效[1]。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，加之藥農(nóng)亂采亂挖等現(xiàn)象，柴胡野生資源數(shù)量急劇減少，加之柴胡因其臨床用量大導(dǎo)致其市售價格連年上漲，目前市場上流通的藥材主要以栽培品北柴胡為主[2-3]。陜西省自古以來就是柴胡的道地產(chǎn)區(qū)[4-5]，寶雞市由于特殊的地理環(huán)境和人文條件，成為陜西省發(fā)展柴胡種植產(chǎn)業(yè)的主要區(qū)域之一[6-7]，2018年陜西省中藥協(xié)會選定的“十大秦藥”中，寶雞柴胡更是位列“十大秦藥”第二名[8]，目前主要涉及陳倉區(qū)、麟游縣等地[9-10]，但不同產(chǎn)區(qū)地形條件差異明顯，種質(zhì)來源不一，致使柴胡質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響中醫(yī)臨床用藥及“寶雞柴胡”品牌推廣[11-12]。因此，明確當(dāng)前柴胡藥材質(zhì)量，選用優(yōu)質(zhì)種源開展規(guī)范化種植是發(fā)展寶雞柴胡及“秦藥”亟待解決的現(xiàn)實(shí)問題。

2020年版《中國藥典》柴胡含量測定項(xiàng)下要求柴胡皂苷a、d的總含量不低于0.30%，此外，黃酮類成分是柴胡屬植物中共有的有效部位[13-14]，因此本文通過測定柴胡皂苷和總黃酮的含量以評價麟游縣柴胡質(zhì)量，以期為麟游縣柴胡種植業(yè)及“秦藥”發(fā)展提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2030C 3D高效液相色譜儀，配有四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱及DAD檢測器(島津Shimadzu)；METTLER AE240分析天平(梅特勒);KQ3200B超聲波清洗器(昆山);UV-1800紫外分光光度計(jì)(島津Shimadzu);EYELAN N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化)。

1.2試劑 柴胡皂苷a、d對照品均購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110777201711);蘆丁購自寶雞辰光生物科技有限公司(批號:HQ105561198，純度>98%);色譜乙腈(瑞士，Oceanpak);娃哈哈純凈水;其余試劑為分析純,均購自天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.3藥材 7批柴胡藥材均于2019年4月收集于寶雞麟游縣，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院郭增軍教授鑒定為北柴胡BupleurumchinenseL.，具體信息見表1。

表1 樣品來源信息表

2 方法

2.1各樣品中柴胡皂苷a、d的含量測定

2.1.1對照品溶液的制備 取柴胡皂苷a、d對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷a 0.5 mg、柴胡皂苷d 0.5 mg的溶液，搖勻，即得。

2.1.2供試品溶液的制備 取本品粉末(過60目篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃水溫超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，濾過，用甲醇30 mL分3次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.1.3色譜條件 Sepax C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈(A)-水(B)，洗脫程序0～27 min，15%～48%A；27～37 min，48%～57%A；37～40 min，57%～71%A；40～55 min，71%～80%A；55～60 min，80%～90%A；60～65 min，90%～90%A；65～70 min，90%～15%A；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測波長210 nm；進(jìn)樣體積20 μL。

2.1.4方法學(xué)考察 對上述方法進(jìn)行線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率考察。以峰面積/106為縱坐標(biāo)(Y)，對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(mg·mL-1，X)計(jì)算回歸方程，結(jié)果表明在0.025～0.1 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，柴胡皂苷a、d線性關(guān)系良好；配制0.25 mg·mL-1的混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)6 d各進(jìn)樣1次，考察儀器精密度；稱取7號樣品約0.5g，精密稱定，按供試品方法處理樣品，分別于0,2,4,8,12,24 h進(jìn)樣分析，考察樣品穩(wěn)定性；稱取7號樣品約0.5 g共6份，精密稱定，按供試品方法處理樣品，計(jì)算柴胡皂苷a、d含量，考察操作重復(fù)性；稱取7號樣品約0.5 g共6份，精密稱定，分別加入0.5 mL的0.25 mg·mL-1混合對照品溶液，考察方法回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，由表可見，該方法精密度、重復(fù)性、回收率高，樣品室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好，可用于樣品的測定。

2.2各樣品中柴胡總黃酮的含量測定

2.2.1對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蘆丁0.5 mg的溶液，搖勻，即得。

表2 柴胡皂苷a、d含量測定實(shí)驗(yàn)方法學(xué)結(jié)果(n=6)

2.2.2供試品溶液的制備 取樣品約0.2 g，精密稱定，加入25 mL甲醇超聲提取15 min后，濾過，回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙庵?0 mL量瓶中，定容，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3顯色方法 精密量取供試品溶液5 mL置于25 mL量瓶中，用水補(bǔ)足至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液l mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以隨行試劑作空白對照，在510 nm波長處測定吸光度[15-17]。

2.2.4方法學(xué)考察 對上述方法進(jìn)行線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率考察，結(jié)果見表3。將蘆丁對照品溶液依次稀釋成0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg·mL-1的對照品溶液，分別精密量取5 mL置于25 mL量瓶中，自“2.2.3 顯色方法 用水補(bǔ)足至6 mL”后操作，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(mg·mL-1,X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明總黃酮測定濃度在0.02～0.5 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；取0.1 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液，按上述顯色方法連續(xù)測定6次，計(jì)算日內(nèi)精密度；稱取7號樣品約0.2 g，精密稱定，按上述供試品制備及顯色方法處理樣品，分別于0，1，2，3，4 h測定吸光度，考察樣品穩(wěn)定性；稱取7號樣品約0.2 g共6份，精密稱定，按上述供試品制備及顯色方法處理樣品，考察方法重復(fù)性；稱取7號樣品約0.5 g共6份，精密稱定，分別加入0.5 mL的0.1 mg·mL-1蘆丁對照品溶液，計(jì)算加樣回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，由表可見，該方法精密度、重復(fù)性、回收率高，樣品室溫放置4h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可用于柴胡樣品總黃酮的含量測定。

表3 總黃酮測定實(shí)驗(yàn)方法學(xué)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)果

3.1各樣品柴胡皂苷a、d的含量測定 稱取充分干燥的7批柴胡根部粉末約0.5 g，平行三份，精密稱定后，按“2.1.2”方法制備供試品溶液后進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算柴胡皂苷a、d的含量。結(jié)果見表4及圖1。

圖1 各柴胡樣品中柴胡皂苷含量差異(虛線為藥典限量0.3%)

表4 各柴胡樣品中柴胡皂苷含量結(jié)果

上述結(jié)果顯示：麟游縣域內(nèi)采購的7批柴胡樣品均高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，其中樣品1～3號均為野生樣品，其柴胡皂苷含量分別高于藥典3.2、2.2、3.0倍，提示我們麟游縣的生態(tài)環(huán)境可能適宜于柴胡藥材有效成分的累積。樣品4～7號為不同種源、不同生長年限的栽培柴胡樣品，其含量存在明顯差異，其中7號樣品(河北安國種源)柴胡皂苷含量達(dá)藥典限量的7.9倍。

3.2柴胡總黃酮的含量測定 稱取充分干燥的7批柴胡粉末約0.2 g，平行三份，精密稱定后，按“2.2.2”方法制備供試品溶液后顯色，測定吸光度，計(jì)算柴胡總黃酮的含量。結(jié)果見表5及圖2。

表5 各柴胡樣品中柴胡總黃酮含量結(jié)果

圖2 各柴胡樣品中柴胡總黃酮含量差異

上述結(jié)果表明：1～3號柴胡均為野生樣品，其總黃酮含量接近，5號(桑樹塬基地)黃酮含量最高，7號(河北安國種源)含量次之。

4 討論

柴胡為我國大宗中藥品種，但由于其悠久的種植歷史悠久，各各市區(qū)生態(tài)條件存在明顯差異、加之各產(chǎn)區(qū)種質(zhì)來源復(fù)雜，導(dǎo)致藥材質(zhì)量不均的問題日趨嚴(yán)重[18-20]，本文從柴胡皂苷和總黃酮含量兩方面綜合評價寶雞麟游縣野生及栽培柴胡質(zhì)量，為進(jìn)一步優(yōu)選種源，確保柴胡質(zhì)量的一致性及可控性，充分發(fā)揮當(dāng)?shù)厣硟?yōu)勢，進(jìn)一步保障藥材質(zhì)量和形成柴胡品牌提供數(shù)據(jù)參考。