郝野陸 牛文民

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅 蘭州 730000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，陜西 咸陽 712000)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指突發(fā)性、威脅性或?yàn)?zāi)難性事件導(dǎo)致個體延遲出現(xiàn)并長期持續(xù)的精神障礙[1-2]。PTSD發(fā)病后具有病程長、難以治愈、自殺率高等特點(diǎn)[3]。因此，創(chuàng)傷性事件暴露后及早干預(yù)以求有效逆轉(zhuǎn)或終止PTSD發(fā)病就顯得尤為重要。然而，目前可用于早期干預(yù)PTSD的有效藥物卻非常少[4]。中藥因其純天然、安全有效、副作用小等特點(diǎn)，在PTSD防治中具有廣闊的應(yīng)用前景[1]，中藥揮發(fā)油經(jīng)嗅覺通路在防治精神類疾病方面取得了較好的療效[5-6]。石菖蒲(AcoriTatarinowii，AT)是一種常用的芳香開竅類中藥，中醫(yī)素有“芳香解郁”之說[5]，石菖蒲揮發(fā)油已經(jīng)用于抑郁癥、焦慮癥及其他精神疾病的治療[7-8]，但關(guān)于石菖蒲揮發(fā)油經(jīng)嗅覺通路對PTSD進(jìn)行早期干預(yù)尚未見報道。

下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸負(fù)反饋增強(qiáng)是PTSD有別于其他精神類疾病如抑郁癥的一個重要特征[3-9]。研究表明，糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)基因與PTSD發(fā)病之間關(guān)系密切[10-11]。最近有學(xué)者認(rèn)為，GR可能是PTSD防治的一個重要干預(yù)靶點(diǎn)[10]。海馬是HPA軸的高位調(diào)節(jié)中樞之一，海馬中的GR密度遠(yuǎn)高于其他腦區(qū)，在調(diào)節(jié)和維持HPA軸功能平衡中起著重要作用[3]。本文通過觀察石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)經(jīng)嗅覺通路對PTSD模型大鼠行為學(xué)的影響，探索其海馬GR基因相關(guān)機(jī)制，一方面為PTSD的早期干預(yù)提供有效藥物，另一方面為中醫(yī)藥防治PTSD提供新的研究思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠，體重(210 ± 20)g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXR(甘)2015-0001，飼養(yǎng)于蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心SPF級清潔鼠房，許可證號：SYXK(甘)2018-0002。

1.2藥品與試劑 石菖蒲飲片(批號：180307211，康美藥業(yè)股份有限公司)；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物科技研究所)；蛋白Marker(Protein Ladder，美國賽默飛世爾科技公司)；GR及β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為市售分析純。

1.3主要儀器設(shè)備 OFT-100開場活動實(shí)驗(yàn)箱及視頻分析系統(tǒng)、PMT-100高架十字迷宮及視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；BCD-178TMPT 4℃、-20℃低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)；Forma 702 -80℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)；Infinite M200酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；Mini-PROTEAN Tetra 165-8001蛋白電泳儀(美國Bio Rad公司)；Rephile Direct-Pure UP超純水系統(tǒng)(上海樂楓生物科技有限公司)；Centrifuge 5424R小型臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；BSA124S-CW電子分析天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；C280化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Azure公司)。

1.4大鼠雙側(cè)嗅神經(jīng)切斷(ONT)及PTSD造模方法 在PTSD造模前3 d，以7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，采用腦立體定位儀將其固定。切開位于大鼠顱頂正中的皮膚后，小范圍分離暴露前囟。在大鼠顱頂正中線位于前囟前面5 mm兩側(cè)旁開2 mm處，分別鉆兩個直徑為1 mm的小孔，以暴露并不損傷嗅球?yàn)橐?。用顯微解剖鑷將嗅球前端的硬腦膜提起，銳性切斷雙側(cè)嗅神經(jīng)，在相應(yīng)部位用明膠海綿壓迫止血，傷口處點(diǎn)青、鏈霉素后對切開部位進(jìn)行縫合。

采用目前公認(rèn)的國際PTSD科學(xué)會議確定的單一延長應(yīng)激(SPS)造模方法來建立PTSD大鼠模型，包含四個部分：束縛應(yīng)激、強(qiáng)迫游泳、乙醚麻醉和孤養(yǎng)。首先，將大鼠水平禁錮于圓錐形束縛器中2 h(使大鼠四肢及軀干束縛在束縛器中，僅尾巴可活動)；隨后立即強(qiáng)迫游泳20 min，水深40 cm，水溫25 ℃；恢復(fù)15 min后用乙醚麻醉至意識喪失；隨后單獨(dú)飼養(yǎng)7 d。

1.5實(shí)驗(yàn)分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分組為：CON(對照)組，PTSD(模型)組，ONT+PTSD(嗅神經(jīng)切斷+模型)組，PTSD+AT(模型+石菖蒲吸嗅)組，ONT+PTSD+AT(嗅神經(jīng)切斷+模型+石菖蒲吸嗅)組，每組8只大鼠。將石菖蒲飲片粉碎過40目篩，經(jīng)超臨界CO2萃取(萃取壓力22.5 MPa，萃取溫度43 ℃，解析壓力4.0 MPa，解析溫度25 ℃，萃取時間126 min)，從萃取釜收集揮發(fā)油備用。將石菖蒲揮發(fā)油、蒸餾水以1∶49濃度配置，盛放于香薰燈內(nèi)，置于密閉的實(shí)驗(yàn)盒底部，并加熱，讓藥物充分揮發(fā)，彌漫整個實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)，后將大鼠放置在中間帶多孔的薄鐵欄柵上，將實(shí)驗(yàn)盒蓋蓋上。PTSD吸嗅組在孤養(yǎng)期間給予每天2次(上下午各一次)、每次1 h、共計(jì)7 d的石菖蒲揮發(fā)油吸嗅處理，PTSD非吸嗅組及CON組在潔凈空氣中自然飼養(yǎng)。

1.6行為學(xué)檢測 行為學(xué)檢測在PTSD組孤養(yǎng)結(jié)束的時間點(diǎn)進(jìn)行，順序如下：拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、開場實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.6.1拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 用手套輕抓大鼠，觀察并記錄其反應(yīng)。具體記分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，很容易抓?。?分，尖叫或回避；2分，尖叫并回避；3分，逃脫；4分，逃脫并尖叫；5分，試圖撕咬手套；6分，主動躍起攻擊。根據(jù)評分來評價大鼠的易激惹程度，評分越高則說明易激惹程度越高。

1.6.2開場實(shí)驗(yàn) 開場實(shí)驗(yàn)裝置是一個75×75 cm的矩形區(qū)域，四周環(huán)繞著防止動物逃走的壁。每一只大鼠被單獨(dú)放在開場的中央，之后在開場中自由活動10 min，期間大鼠的活動被相應(yīng)的軟件錄像并分析。在一只大鼠測試結(jié)束之后，用75%的酒精溶液將開場擦拭干凈，之后進(jìn)行下一只大鼠的測試。大鼠在開場實(shí)驗(yàn)中的中央活動路程百分比被作為反映焦慮水平的指標(biāo)，百分比越高，則說明焦慮水平越低。

1.6.3高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮外形似“+”，離地50 cm，從中央平臺(10 cm×10 cm)向四周延伸出2個相對的閉臂(45 cm×40 cm×10 cm)和2個相對的開臂(45 cm×10 cm)。每只大鼠被單獨(dú)放在迷宮的中央，面對其中一個開臂，之后在迷宮中自由活動5 min。大鼠在迷宮中的活動被相應(yīng)的軟件錄像并分析。大鼠在迷宮中的開臂進(jìn)入次數(shù)百分比被作為反映焦慮水平的指標(biāo)，百分比越高，則說明焦慮水平越低。

1.7Western blot法測定蛋白表達(dá) 在PTSD組孤養(yǎng)結(jié)束的時間點(diǎn)進(jìn)行大鼠海馬組織取材。7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后以頸椎脫臼法處死，并斷頸取頭，取出大鼠海馬組織。常規(guī)方法檢測大鼠海馬組織中GR蛋白表達(dá)并定量。蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后，行封閉、一抗、二抗雜交等步驟，化學(xué)發(fā)光顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)測定光密度值。計(jì)算檢測的目的蛋白(GR)與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶的光密度比值來表示檢測蛋白的表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對于各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，對于組間均數(shù)的兩兩比較采用最小顯著差數(shù)(LSD)法，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性定義為P<0.05，用GraphPad Prism 9.0繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)減輕了PTSD模型大鼠的易激惹程度 與對照組大鼠相比，PTSD模型組大鼠在拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中的評分明顯升高(P<0.05)，表明其易激惹程度明顯升高。經(jīng)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)，PTSD模型大鼠的易激惹程度有所減輕(P>0.05)。行雙側(cè)嗅神經(jīng)切斷的PTSD模型大鼠經(jīng)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)，與PTSD模型組大鼠相比，其易激惹程度未見明顯變化。PTSD模型大鼠行雙側(cè)嗅神經(jīng)切斷后，其易激惹程度未見明顯變化。詳見圖1。

圖1 石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)對PTSD模型大鼠在拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(RTC)中評分的影響

2.2石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)明顯減輕了PTSD模型大鼠的焦慮水平 與對照組大鼠相比，PTSD模型組大鼠在開場實(shí)驗(yàn)中的中央活動路程百分比明顯降低(P<0.01)，在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的開臂進(jìn)入次數(shù)百分比明顯降低(P<0.001)，表明其焦慮水平明顯升高。經(jīng)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)，PTSD模型大鼠的焦慮水平明顯減輕，表現(xiàn)為在開場實(shí)驗(yàn)中的中央活動路程百分比明顯升高(P<0.05)，以及在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的開臂進(jìn)入次數(shù)百分比明顯升高(P<0.05)。行雙側(cè)嗅神經(jīng)切斷的PTSD模型大鼠經(jīng)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)，與PTSD模型組大鼠相比，其焦慮水平未見明顯變化。PTSD模型大鼠行雙側(cè)嗅神經(jīng)切斷后，其焦慮水平未見明顯變化。詳見圖2、圖3。

2.3石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)對PTSD模型大鼠海馬GR蛋白表達(dá)水平的影響 與對照組大鼠相比，PTSD模型組大鼠海馬GR蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。經(jīng)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)，PTSD模型大鼠海馬GR蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。行雙側(cè)嗅神經(jīng)切斷的PTSD模型大鼠經(jīng)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)，與PTSD模型組大鼠相比，其海馬GR蛋白表達(dá)水平未見明顯變化。PTSD模型大鼠行雙側(cè)嗅神經(jīng)切斷后，其海馬GR蛋白表達(dá)水平未見明顯變化。詳見圖4。

圖2 石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)對PTSD模型大鼠在開場實(shí)驗(yàn)中的中央活動路程百分比的影響

圖3 石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)對PTSD模型大鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的開臂進(jìn)入次數(shù)百分比的影響

圖4 石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)對PTSD模型大鼠海馬GR蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

PTSD是指突發(fā)性、威脅性或?yàn)?zāi)難性事件導(dǎo)致個體延遲出現(xiàn)并長期持續(xù)的精神障礙[1- 2]，是目前世界范圍內(nèi)廣泛關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題之一[3]。PTSD發(fā)病后具有病程長、難以治愈、自殺率高等特點(diǎn)[3]，不僅給患者及其家庭帶來嚴(yán)重影響，也給社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)。因此，創(chuàng)傷性事件暴露后及早干預(yù)以求有效逆轉(zhuǎn)或終止PTSD發(fā)病就顯得尤為重要?，F(xiàn)有PTSD的早期干預(yù)方法主要分為早期心理干預(yù)和早期藥物干預(yù)兩種[12]。但早期心理干預(yù)存在主觀性強(qiáng)、缺乏外部評價體系、客觀指標(biāo)少、個體差異大等不足[12-13]。據(jù)PTSD研究現(xiàn)狀而言，早期藥物干預(yù)較之早期心理干預(yù)更為理想[12]。然而，目前可用于早期干預(yù)PTSD的有效藥物卻非常少[4]。因此，尋找能夠及早干預(yù)PTSD的有效藥物并深入探索其作用機(jī)制具有重大意義。

中藥因其純天然、安全有效、副作用小等特點(diǎn)，在PTSD防治中具有廣闊的應(yīng)用前景[1,14]。研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)驚溫膽湯可改善PTSD模型大鼠的焦慮和恐懼狀態(tài)[15]；加味逍遙散可通過刺激別孕烯醇酮的合成從而改善PTSD模型大鼠的行為異常[16]。嗅覺是人類最基本的感覺之一，嗅覺功能與抑郁癥、焦慮癥、PTSD、精神分裂癥等多種精神疾病有關(guān)[17-19]。中藥揮發(fā)油是存在于某些中藥材中的一類具有揮發(fā)性的液體成分，具有獨(dú)特的芳香氣味和經(jīng)鼻入腦的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。中醫(yī)素有“芳香解郁”之說[5]，中藥揮發(fā)油經(jīng)嗅覺通路防治精神類疾病具有易于透過血腦屏障、患者依從性好、副作用小等特點(diǎn)[5-6]。研究表明，蒼艾揮發(fā)油霧化吸入在大鼠慢性不可預(yù)見應(yīng)激致抑郁模型中發(fā)揮保護(hù)作用[20]；蘇合香揮發(fā)油吸嗅在小鼠急性應(yīng)激致抑郁模型中具有抗抑郁和抗焦慮的作用[21]。但中藥揮發(fā)油經(jīng)嗅覺通路發(fā)揮對PTSD的防治作用尚未見報道。

石菖蒲是天南星科多年生草本植物石菖蒲的干燥根莖，其性溫，味辛、苦，具有芳香之氣，歸心、胃二經(jīng)，是一種臨床上常用的芳香開竅類中藥[22-24]。石菖蒲揮發(fā)油主要成分包括α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚，活性均較強(qiáng)，是其發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，有學(xué)者認(rèn)為石菖蒲主要通過其揮發(fā)油發(fā)揮藥理作用[6,8]。石菖蒲揮發(fā)油已經(jīng)用于抑郁癥、焦慮癥及其他精神疾病的治療[7,8,25]，但關(guān)于石菖蒲揮發(fā)油經(jīng)嗅覺通路對PTSD進(jìn)行早期干預(yù)尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)，PTSD模型大鼠在開場實(shí)驗(yàn)中的中央活動路程百分比明顯升高(P<0.05)，在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的開臂進(jìn)入次數(shù)百分比明顯升高(P<0.05)，在拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中的評分亦有所降低(P>0.05)，表明石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)減輕了PTSD模型大鼠的易激惹程度及焦慮水平。行雙側(cè)嗅神經(jīng)切斷的PTSD模型大鼠經(jīng)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)，與PTSD模型組大鼠相比，其焦慮水平未見明顯變化，說明石菖蒲揮發(fā)油有效作用的發(fā)揮有賴于嗅覺通路結(jié)構(gòu)的完整性，提示石菖蒲揮發(fā)油吸嗅經(jīng)嗅覺通路在早期干預(yù)PTSD中發(fā)揮有效作用。本研究所提出經(jīng)嗅覺通路早期干預(yù)PTSD的新理念，以及發(fā)現(xiàn)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅在早期干預(yù)PTSD中的有效作用，均尚屬國內(nèi)外首次，原創(chuàng)性強(qiáng)，是中醫(yī)科研思路與中醫(yī)防治精神疾病探索的深入與創(chuàng)新。

HPA軸負(fù)反饋增強(qiáng)是PTSD有別于其他精神類疾病如抑郁癥的一個重要特征[3,9]。海馬是HPA軸的高位調(diào)節(jié)中樞之一，海馬中的GR密度遠(yuǎn)高于其他腦區(qū)，在調(diào)節(jié)和維持HPA軸功能平衡中起著重要作用[3]。研究表明，PTSD模型大鼠海馬中GR表達(dá)增加，可能引起了HPA軸負(fù)反饋增強(qiáng)[9-11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PTSD患者海馬、杏仁核和內(nèi)側(cè)前額葉皮層均出現(xiàn)GR表達(dá)異常的現(xiàn)象[26]。因此最近有學(xué)者認(rèn)為，GR可能是PTSD防治的一個重要干預(yù)靶點(diǎn)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PTSD模型大鼠海馬GR蛋白表達(dá)水平升高，這與之前的研究相一致[27-29]。經(jīng)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)，PTSD模型大鼠海馬GR蛋白表達(dá)下調(diào)，這提示石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)PTSD的作用機(jī)制可能與海馬GR基因有關(guān)。關(guān)于GR基因調(diào)控的機(jī)制，最近的研究發(fā)現(xiàn)，GR基因的甲基化修飾在其中發(fā)揮重要作用[30-32]。但本次實(shí)驗(yàn)未對大鼠海馬GR基因的甲基化水平進(jìn)行檢測，為不足之處，將留待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲揮發(fā)油吸嗅早期干預(yù)減輕了PTSD模型大鼠的易激惹程度及焦慮水平，其作用的發(fā)揮有賴于嗅覺通路結(jié)構(gòu)的完整性，提示石菖蒲揮發(fā)油吸嗅經(jīng)嗅覺通路在早期干預(yù)PTSD中發(fā)揮有效作用，其作用機(jī)制可能與海馬GR基因有關(guān)。