杜 玲，張加雪，袁靈月，諶麗妃，李迎麗，邱景富

(重慶醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016)

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）是革蘭陰性桿菌，根據(jù)致病性分為2 個類型：經(jīng)典肺炎克雷伯菌（classicKlebsiella pneumonia，cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumonia，hvKP）[1-2].K.pneumoniae在臨床上可引起泌尿道感染、菌血癥、化膿性肝膿腫和腦膜炎等疾病，相關(guān)的毒力因子包括莢膜多糖、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、菌毛（fimbriae）及鐵載體（siderophores）等[3]，其中鐵載體包括氣桿菌素、腸桿菌素、沙門菌素和耶爾森菌素4 類.與cKP 相比，hvKP 具有更強(qiáng)的攝鐵能力可分泌更多的鐵載體，是其毒力特征之一[4].

鐵對于大多數(shù)生物來說是生長過程中的必需元素，它作為一些酶的輔因子在物質(zhì)代謝、DNA 的合成和基因調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用[5-6].然而過量的鐵會通過Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生活性氧（ROS），從而對細(xì)胞大分子造成損害.隨著環(huán)境改變，原核細(xì)胞和真核細(xì)胞均已演變出一系列維持鐵穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，其中鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白（ferric uptake regulator，F(xiàn)ur）起主導(dǎo)作用[7].當(dāng)胞內(nèi)鐵含量過高時，F(xiàn)ur 與Fe2+形成二聚體，結(jié)合在靶基因的啟動子區(qū)抑制靶基因轉(zhuǎn)錄和鐵攝取相關(guān)基因的表達(dá)[8]，某些情況下，F(xiàn)ur 也可以起激活劑的作用[9-11]；當(dāng)環(huán)境中的鐵受到限制時，F(xiàn)ur?Fe2+復(fù)合物解離，形成Fur 單體，進(jìn)而解除其抑制作用.同時，缺鐵條件下會誘導(dǎo)細(xì)菌鐵載體合成基因的表達(dá)，生成的鐵載體分泌到環(huán)境中以結(jié)合鐵，細(xì)胞通過外膜受體和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白將鐵?鐵載體復(fù)合物運輸?shù)桨麅?nèi)以滿足生長需要[12].

強(qiáng)毒力島（high pathogenicity island，HPI）在腸桿菌科中廣泛存在，與致病性及毒力密切相關(guān)，所攜帶的基因主要參與鐵載體耶爾森菌素的合成、調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)運[13].HPI 由功能核心區(qū)和可變區(qū)兩部分構(gòu)成，菌群之間會發(fā)生水平轉(zhuǎn)移[14].目前，已在大腸桿菌、沙門菌、霍亂弧菌及克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)HPI 的存在[15-16].與大腸桿菌序列進(jìn)行比較，K.pneumoniae存在HPI 中的部分基因，即irp2、irp1、ybtU、ybtT、ybtE和fyuA，其中fyuA基因作為耶爾森菌素的受體，是HPI 基因簇的核心基因之一.有相關(guān)文獻(xiàn)報道fyuA與許多腸桿菌科細(xì)菌毒力相關(guān)[17]，而K.pneumoniae中 對fyuA的研究 卻鮮有報道.我們通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)K.pneumoniae中fyuA基因啟動子區(qū)可能存在Fur 的結(jié)合位點.

Fur 蛋白由fur基因編碼，是一個全局性調(diào)控因子，能與其他調(diào)控系統(tǒng)協(xié)同作用，在維持細(xì)菌鐵穩(wěn)態(tài)時，也影響著細(xì)菌的生理和代謝[7].大多數(shù)生物體內(nèi)都有Fur 蛋白的存在，并已證明它在物種之間具有高度的序列同源性，且有相似的空間結(jié)構(gòu).在大腸桿菌中，已對Fur 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式進(jìn)行了深入研究，建立出完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[18].不同細(xì)菌體內(nèi)Fur 功能存在差異，而細(xì)菌的特異性造成敲除fur基因后呈現(xiàn)不同的表型變化[19-21].目前在肺炎克雷伯菌中缺少對Fur 的研究，F(xiàn)ur 對fyuA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制也尚不清楚.故本研究采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建肺炎克雷伯菌fur基因缺失株，對其功能進(jìn)行研究；并通過分子實驗明確Fur 對fyuA的調(diào)控機(jī)制，為肺炎克雷伯菌的深入研究提供實驗依據(jù)與材料.

1 材料與方法

1.1 實驗菌株和質(zhì)粒肺炎克雷伯菌NTUH?K2044、溫敏型自殺載體質(zhì)粒pKO3?km（含卡那霉素抗性基因和一個sacB基因）受贈于臺灣大學(xué)的Jing-Town Wang 教授，熒光質(zhì)粒pPRObe?gfp（卡那霉素抗性）購自addgene 公司，菌株E.coliDH5α 和質(zhì)粒pBAD33（氯霉素抗性）由本實驗室保存.

1.2 主要試劑與引物Pfu DNA聚合酶、ExTaqDNA 聚合酶、dNTPs 均購自寶生物工程大連有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、T4 Buffer為New England Biolabs 公司產(chǎn)品；PCR 純化試劑盒、PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Takara 公司產(chǎn)品；RNeasy mini kit 試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒為Qiagen 公司產(chǎn)品；其他常用生化試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.本實驗所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1.

表1 實驗所用引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.3 突變株Δfur 及回補株C?Δfur 的構(gòu)建以野生株NTUH?K2044 總DNA 為模板，采用融合PCR得到敲除fur基因的上下游同源臂拼接片段后，克隆到自殺質(zhì)粒pKO3?Km 上.將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pKO3?km?Δfur電轉(zhuǎn)入NTUH?K2044 的感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組并利用蔗糖反向篩選出無痕突變株Δfur.PCR 擴(kuò)增得到fur片段，與pBAD33 表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切連接，通過電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入突變株Δfur中篩選出C?Δfur菌株，具體方法見參考文獻(xiàn)[22].

1.4 生長曲線分別將野生株、突變株、回補株的單菌落接于15 mL LB 培養(yǎng)基中（回補株中加入35 μg/mL 氯霉素），37 ℃，200 r/min 過夜培養(yǎng).次日，按1∶100 接種量轉(zhuǎn)接至50 mL LB 或含有200 μmol/L 2,2′?dipyridyl 的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)；每隔2 h 測定培養(yǎng)物的OD600值，持續(xù)檢測20 h，每個時間點重復(fù)檢測3 次取其平均值.使用GraphPad Prism 8.0.1 軟件繪制生長曲線.

1.5 CAS 檢測法使用鉻天青S（CAS）瓊脂平板和溶液測量鐵載體的生成量.從平板上挑取野生株和突變株的單菌落接于15 mL MM9 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，回補株單菌落接于15 mL MM9 培養(yǎng)基中（含氯霉素 35 μg/mL），37 ℃，200 r/min 過夜培養(yǎng).次日，將細(xì)菌懸液OD600值調(diào)至同一水平，取5 μL 點于CAS平板上，并在37 ℃下培養(yǎng)14 h，通過細(xì)菌菌落周圍橘黃色螯合圈大小初步判定鐵載體的生成.為了定量測定鐵載體的產(chǎn)生，將過夜培養(yǎng)的菌液按1%轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600為1.5.每株菌各取0.5 mL 細(xì)菌懸液離心10 min，將上清液稀釋30 倍后加入0.5 mL CAS 檢測液，再加入10 μL Shuttle 溶液，混勻反應(yīng)30 min 后，使用分光光度計測量630 nm 處的吸光度，重復(fù)測定3 次.鐵載體的生成計算如下：

鐵載體相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)=[(Ar?As)/Ar]×100%，其中As和Ar分別代表樣品組和對照組的吸光度.

1.6 結(jié)晶紫實驗野生株、突變株和回補株的單菌落接于15 mL LB 培養(yǎng)基中（回補株中含氯霉素35 μg/mL），28 ℃，200 r/min 過夜培養(yǎng).次日，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600為1.0，再1∶100 稀釋至裝有2 mL MM9 肉湯的玻璃試管中28 ℃靜置培養(yǎng).將培養(yǎng)24、36、48 h 生物膜的試管取出，吸出菌液后用ddH2O 潤洗3 次，烘箱靜置15 min 烘干；加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，ddH2O 潤洗5 次；加入DMSO，每管2 mL，放置1～2 h 溶解結(jié)晶紫.

生物膜 的相對 形成量=1 000×OD570/(OD600×V1×V2)[23]，其中，V1為初始菌液體積(mL)，V2為DMSO 體積(mL).

1.7 GFP 報告基因融合實驗將NTUH?K2044中fyuA基因啟動子區(qū)域的片段經(jīng)PCR 擴(kuò)增后克隆到pPROBE?gfp質(zhì)粒gfp基因上游.再通過電轉(zhuǎn)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPROBE?fyuA導(dǎo)入K2044 和Kp∶Δfur中，pPROBE?gfp電轉(zhuǎn)入K2044 中.所得菌株分別接入MM9 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（含Kan 50 μg/mL），37 ℃過夜培養(yǎng)；次日，按1∶100 轉(zhuǎn)接至MM9 培養(yǎng)基或含有100 μmol/L FeSO4的MM9 培養(yǎng)基中（含Kan 50 μg/mL 培養(yǎng)6 h.測量菌液OD600值并將其調(diào)至同一水平0.2 左右，每個菌株做3 份，用ELx808酶標(biāo)儀測定相對熒光量（RFU），計算RFU/OD600的值.

1.8 實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT?qPCR)從平板上挑取K2044 和Kp∶Δfur的單菌落于15 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過夜培養(yǎng).按1∶100 將菌株分別轉(zhuǎn)接于含F(xiàn)eSO4（終濃度為100 μmol/L）的LB培養(yǎng)基中至OD600為1.0，使用試劑盒裂解細(xì)菌后提取總RNA.通過分光光度計對RNA 進(jìn)行定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性.逆轉(zhuǎn)錄按PrimeScript?試劑盒要求操作，使RNA 轉(zhuǎn)化為cDNA.使用CFX96 Real?Time PCR 系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)，以rho基因作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt計算fyuA基因的相對表達(dá)量.

1.9 數(shù)據(jù)處理每組實驗重復(fù)至少3 次，應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.1 軟件作圖，SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.定量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD 檢驗.P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 突變株的構(gòu)建用PCR 篩選出無痕突變株.以突變株基因組DNA 作為模板，KP1_fur?A/D 為引物對進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物大小為1 135 bp（圖1 泳道3），對應(yīng)的條帶低于以野生株為模板擴(kuò)增獲得的大小為1 590 bp（圖1 泳道1）的片段.以野生株基因組DNA 作為模板，內(nèi)引物對KP1_fur?RT?F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時，得到大小為191 bp（圖1泳道4）的片段，而突變株無擴(kuò)增產(chǎn)物.結(jié)果(圖1)表明電泳結(jié)果符合預(yù)期，成功構(gòu)建突變株Δfur.

圖1 突變株Δfur 的PCR 鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of mutant strain Δfur by PCR

2.2 回補株的構(gòu)建以NTUH?K2044 和C?Δfur基因組DNA 為模板，KP1_fur?HB?KpnI?F/KP1_fur?HB?HindⅢ?R 為引物進(jìn)行驗證.結(jié)果見圖2，以回補株作為模板的PCR 產(chǎn)物大?。ㄓ镜?）與野生株作為模板時產(chǎn)物大小一致，表明成功構(gòu)建回補株C?Δfur.

圖2 回補株C?Δfur 的PCR 鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of complementation strain C?Δfur by PCR

2.3 生長曲線為了探究敲除fur基因是否對菌株的生長速率產(chǎn)生影響，在有鐵和缺鐵環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)菌，通過測定不同時間點的OD600值繪制生長曲線（圖3）.結(jié)果顯示，2 種環(huán)境下3 株菌株的生長趨勢整體一致，但不同時間點對應(yīng)的菌濃度（以O(shè)D600值計算）存在差異.通過t檢驗可知，無論是有鐵環(huán)境還是缺鐵環(huán)境，野生株和回補株的生長速度均快于突變株且具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明fur基因?qū)?xì)菌的生長具有一定影響.

圖3 不同環(huán)境下菌株的生長曲線Fig.3 Growth curves of strains under different environments

2.4 鐵載體生成能力測定

2.4.1 CAS 平板檢測 利用CAS 平板檢測野生株、突變株及回補株鐵載體生成量.從圖4 中可以看出，幾株菌均能產(chǎn)生橘黃色螯合圈，但是螯合圈直徑大小各異，表明鐵載體生成量有所差異.在藍(lán)色CAS 平板上能明顯看到Δfur菌株周圍的螯合圈最大，回補株C?Δfur產(chǎn)生的黃色螯合圈大小介于突變株Δfur與野生株WT 之間.在野生株中導(dǎo)入空質(zhì)粒構(gòu)建WT?vector 重組質(zhì)粒，所產(chǎn)生的螯合圈大小與野生株相同，排除質(zhì)粒所產(chǎn)生的影響.因此，實驗表明fur與細(xì)菌鐵載體合成相關(guān).

圖4 CAS 平板檢測細(xì)菌產(chǎn)鐵載體的能力Fig.4 The ability of bacteria to produce siderophores detected by CAS plate

2.4.2 CAS 液體檢測 通過CAS 液體檢測對4株菌生成的鐵載體進(jìn)行定量分析，利用630 nm 處測得的吸光度計算鐵載體的相對形成量.結(jié)果見圖5，可以看出突變株生成的鐵載體多于野生株和回補株，而回補株低于突變株.結(jié)果與定性實驗CAS 平板檢測結(jié)果一致，即Fur 會影響肺炎克雷伯菌鐵載體的形成.

圖5 鐵載體的相對形成量Fig.5 Relative content of siderophores

2.5 Fur 影響生物膜的形成生物膜的形成對肺炎克雷伯菌的生存及感染起重要作用.通過結(jié)晶紫染色實驗計算分析，發(fā)現(xiàn)24、36 h 處野生株形成生物膜的量明顯多于突變株，培養(yǎng)至48 h 野生株與回補株形成生物膜的能力均強(qiáng)于突變株（圖6）.結(jié)果表明Fur 正向調(diào)控肺炎克雷伯菌生物膜的生成.

圖6 生物膜的相對形成量Fig.6 The relative amount of biofilm formation

2.6 Fur 通過作用于fyuA 啟動子區(qū)域調(diào)控基因的表達(dá)Fur 作為鐵響應(yīng)調(diào)控因子，參與胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)并影響相關(guān)基因的表達(dá)，實驗通過改變環(huán)境中的鐵含量探索Fur 對fyuA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPROBE?fyuA分別電轉(zhuǎn)入Kp2044 與Kp：Δfur中，經(jīng)GFP 報告基因融合實驗測定其相對熒光量并分析目的基因的表達(dá).結(jié)果如圖7，菌株在MM9 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長，Kp2044/pPROBE?fyuA和Kp：Δfur/pPROBE?fyuA的熒光表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異；添加100 μmol/L FeSO4至MM9 培養(yǎng)基中，在鐵充足條件下，Kp2044/pPROBE?fyuA與Kp：Δfur/pPROBE?fyuA相比熒光表達(dá)量顯著降低；添加250 μmol/L Dip 至MM9 培養(yǎng)基時，Kp2044/pPROBE?fyuA和Kp：Δfur/pPROBE?fyuA的熒光表達(dá)量雖有差異，但均高于有鐵環(huán)境下的表達(dá)量，表明鐵充足條件下Fur 抑制fyuA基因的表達(dá).提取細(xì)菌總RNA 通過RT-qPCR進(jìn)一步證明，在鐵充足環(huán)境中，F(xiàn)ur 負(fù)調(diào)控fyuA的表達(dá).

圖7 Fur 對fyuA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控Fig.7 Transcriptional regulation offyuA by Fur

3 討論

Fur 作為病原菌中存在的整體調(diào)控子，在鐵代謝中扮演了重要角色.同時，不同菌株間Fur 發(fā)揮的功能不盡相同，比如：金黃色葡萄球菌fur基因的缺失使菌株表現(xiàn)出生長缺陷和對H2O2的高敏性，生物膜的形成量也隨之增加[19]；銅綠假單胞菌fur的缺失使其生長受損，生物膜的形成卻無影響[21]；而同屬革蘭氏陰性菌的霍亂弧菌敲除fur基因后，生物膜的形成增加，定殖能力減弱[20].本研究經(jīng)生長曲線分析可知，fur基因的缺失使菌株的生長受到抑制，表明Fur 影響K.pneumoniae的生長增殖.通過對fur基因敲除株鐵載體的形成能力進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)Δfur突變株產(chǎn)生的螯合圈最大，fur基因的缺失使菌株鐵載體的分泌量增加，說明Fur 影響肺炎克雷伯菌鐵的攝取，進(jìn)而對其毒力產(chǎn)生影響.

肺炎克雷伯菌生物膜的形成能力與耐藥性及致病性密切相關(guān)，且受多種調(diào)控因子及靶基因的影響[24].當(dāng)環(huán)境改變時，微生物可通過分泌、釋放一些特定的信號分子調(diào)控生理功能，這種適應(yīng)環(huán)境變化的交流機(jī)制稱群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）[25]，它貫穿K.pneumoniae生物膜形成的整個過程.Wu等[26]研究結(jié)果表明，37 ℃下培養(yǎng)肺炎克雷伯菌fur基因敲除株會減少生物膜的形成.本研究在37 ℃下培養(yǎng)野生株NTUH?K2044、突變株Δfur及回補株C?Δfur，3 株菌的生物膜形成量無統(tǒng)計學(xué)差異；將溫度降至28 ℃，發(fā)現(xiàn)Fur 對K.pneumoniae生物膜的形成起正調(diào)控作用，與Wu 等[26]結(jié)果一致.溫度對生物膜的形成產(chǎn)生影響，猜測Fur 及群體感應(yīng)過程產(chǎn)生的某些分子共同調(diào)控K.pneumoniae生物膜的形成.值得注意的一點，試管壁生物膜不斷加厚，使得生物膜的活性及粘附受到影響，外力作用下可引起其部分脫落丟失.這是實驗中觀察到野生株生物膜形成量為不斷增加的過程，但實際測得36、48 h 處生物膜的生成量相對減少的原因.

本研究通過RT?qPCR 和GFP 報告基因融合實驗明確了Fur 對fyuA的調(diào)控，鐵充足條件下Fur 抑制fyuA的表達(dá).Fur 可與其他調(diào)控因子共同作用影響菌株的生理活動及代謝，如環(huán)磷酸腺苷受體蛋白（cAMP receptor protein，CRP）對細(xì)菌的運動、生物膜形成及毒力因子產(chǎn)生都有一定的調(diào)控作用[27].故培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑Dip 造成鐵缺乏時，野生株與突變株之間fyuA的表達(dá)量存在差異.然而，F(xiàn)ur對fyuA的調(diào)控方式以及是否對K.pneumoniae的毒力產(chǎn)生影響需進(jìn)一步深入研究.因HPI 具有可移動性，轉(zhuǎn)移過程會發(fā)生部分基因缺失或修飾，故不同菌株之間HPI 可能存在差異[14]，它在K.pneumoniae中轉(zhuǎn)移及功能也有待探索.

4 結(jié)論

本研究采用同源重組的基因敲除技術(shù)成功構(gòu)建突變株，并通過生長曲線、CAS 檢測和結(jié)晶紫染色實驗發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌的生長、鐵載體及生物膜的形成均與fur基因相關(guān).Fur 作為一個重要的調(diào)控因子，當(dāng)環(huán)境中的鐵充足時，F(xiàn)ur 負(fù)調(diào)控耶爾森菌素受體fyuA基因的表達(dá).這為后續(xù)深入探索Fur 在肺炎克雷伯菌中的功能和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)并提供新思路.