羅才琴，肖素蕓，呂 冬，曲 媛,2,3，崔秀明,2,3**，段嫏環(huán)

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省三七資源可持續(xù)利用重點實驗室，云南 昆明 650500；3.國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系昆明綜合試驗站，云南 昆明 650500)

三烏膠丸又稱“云南黑藥”曾與“云南白藥”齊名，傳統(tǒng)用于治療風(fēng)寒濕邪、中風(fēng)偏癱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性肌炎、骨質(zhì)增生等[1].目前，發(fā)現(xiàn)三烏膠丸治療腦卒中后遺癥有效率達95%以上[2].三烏膠丸由生草烏、生川烏、何首烏、附片、生白附子等 5 種藥材組成，其中黃草烏、川烏、附片為劇毒[3-5]藥材.三烏膠丸中烏頭堿類二萜生物堿既是活性成分也是毒性成分，其中生黃草烏、生川烏等劇毒藥材經(jīng)過三烏膠丸的處方工藝蒸煮后，其雙酯型毒性較大的生物堿如烏頭堿[6]、滇烏堿等逐漸向單酯型毒性較小的生物堿轉(zhuǎn)化.因此，本研究選取了轉(zhuǎn)化后含量較高且有指標(biāo)意義的烏頭類二萜生物堿作為三烏膠丸的含量控制指標(biāo)，并且同時測定了三烏膠丸中佐藥何首烏的指標(biāo)性成分大黃素.

中藥指紋圖譜技術(shù)可對中藥進行質(zhì)量評價，是國際公認(rèn)的質(zhì)控可行模式，是中成藥療效的保證[7].目前，相關(guān)文獻對三烏膠丸的質(zhì)量控制研究主要集中在單個藥材或單個成分的含量測定[8-9]，未見三烏膠丸的指紋圖譜及多指標(biāo)成分測定的報道，不足以控制三烏膠丸的整體質(zhì)量.此外，未見同時測定烏頭類生物堿和蒽醌類成分的報道.基于此，本研究所開發(fā)的三烏膠丸HPLC 指紋圖譜的方法，同時對15 個批次的三烏膠丸中包括烏頭類生物堿和大黃素在內(nèi)的6 個活性成分進行含量測定，為三烏膠丸的質(zhì)量控制和評價提供理論及實驗依據(jù).

1 材料

1.1 儀器電子天平（AL-104 型，梅特勒?托利多儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國艾卡科技有限公司，IKA-RV3）；高效液相色譜儀（Agilent1260，安捷倫科技有限公司）；超聲波清洗器（KQ-5200E 型，昆山市超聲儀器有限公司）；優(yōu)普系列超純水器(UPTI-20T 型，成都超純科技有限公司)

1.2 材料苯甲酰烏頭原堿（wkq20041505）、苯甲酰次烏頭原堿（wkq20041702）、苯甲酰新烏頭原堿（wkq20041701）購自四川省維克奇生物科技有限公司.草烏甲素（Yz042122）、8?去乙酰滇烏堿（Yz0201221）、大黃素甲醚（Yz040122）、大黃素（Yz080920）來源于南京源植生物科技有限公司.磷酸、乙腈為色譜級，二乙胺、乙醚、石油醚（沸程在30～60 ℃）、氨水為分析純，水為超純水.

1.3 樣品黃草烏Aconitum vilmorinianumKom.為毛茛科烏頭屬多年生草本植物的干燥塊根（產(chǎn)地：云南，批號：200301）；川烏為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的干燥母根（產(chǎn)地：陜西，批號：171201）；附片（黑順片）為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的子根的加工品（產(chǎn)地：四川，批號：191002）；何首烏為為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根（產(chǎn)地：云南，批號：200601）；白附子為天南星科植物獨角蓮Typhonium giganteumEngl.的干燥塊莖，此處所用為禹白附（產(chǎn)地：四川，批號：191101）；三烏膠丸（規(guī)格：5 g ×12 袋），批 號：190651、190906、190907、190908、200602、200603、200604、200901、200902、200903、200606、200607、200608、200611、200612，編號依次為S1～S15）均由云南金烏黑藥制藥有限公司提供.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件測定波長：245 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；色譜分析柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(?4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為0.2%二乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH 為4.0）水溶液(A)?乙腈(B)，梯度洗脫（0～15 min，10%～20%B；45～55 min，40%～70%B，70～75 min，70%～100%B，85～100 min，100%B）.

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取苯甲酰新烏頭原堿（BMA）、苯甲酰次烏頭原堿（BHA）、苯甲酰烏頭原堿（BA）、8?去乙酰滇烏堿（8-DYA）、草烏甲素（CCA）、大黃素（ED）的對照品適量，精密稱定，用酸性甲醇（每100 mL 甲醇里面精確加入鹽酸1 mL）配制成含大黃素2 mg/mL，8?去乙酰滇烏堿1.8 mg/mL，草烏甲素2.1 mg/mL，苯甲酰新烏頭原堿2.8 mg/mL，苯甲酰次烏頭原堿1.9 mg/mL，苯甲酰烏頭原堿2.6 mg/mL 的混合對照品溶液，待用.

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取三烏膠丸粉末（過0.356 mm 篩，50 目）1.0 g，加入石油醚5 mL后低溫超聲(250 W，50 kHz)5 min 后，靜置，40 ℃以下?lián)]干石油醚.三烏膠丸殘渣加入氨溶液3 mL，潤濕；加入乙醚20 mL，稱定質(zhì)量，低溫超聲60 min后，用乙醚補足失量；再同法處理1 次.合并2 次乙醚液，32 ℃以下減壓濃縮揮干，殘渣加入酸性甲醇1 mL 溶解，過有機系0.45 μm 濾膜，備用.

2.2.3 單味藥和陰性對照品溶液的制備 按三烏膠丸的處方工藝分別制備三烏膠丸的黃草烏、川烏、附片（黑順片）、何首烏的單味藥樣品和缺黃草烏、缺川烏附子、缺何首烏的陰性對照品.按照“2.2.2”下的方法對單味藥樣品及三烏膠丸的陰性對照品進行提取，制成單味藥樣品溶液和陰性對照品溶液備用.

2.3 三烏膠丸HPLC 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 按本文所述色譜條件連續(xù)進針6 次同一份三烏膠丸（批號：200903）的供試品溶液10 μL，記錄HPLC 圖.以5 號峰苯甲酰新烏頭原堿（S）為對照峰，通過計算得到18 個三烏膠丸共有特征峰的相對保留時間RSD<0.42%，18 個三烏膠丸共有特征峰的相對峰面積的RSD<2.97%，表明本文方法精密度良好.

2.3.2 重復(fù)性試驗 按照本文所述的方法取同一個批次的三烏膠丸各1.0 g（批號：200903）制作相同的6 份三烏膠丸供試品溶液，進樣上述三烏膠丸樣品溶液6 份10 μL 測定，記錄HPLC 圖.以5號峰苯甲酰新烏頭原堿（S）為對照峰，通過計算得到18 個三烏膠丸共有特征峰的相對保留時間的RSD<0.45%，18 個三烏膠丸共有特征峰的相對峰面積的RSD<3.68%，方法重復(fù)性良好.

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 按本文三烏膠丸的色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h 進樣同一份三烏膠丸樣品溶液（批號：200903）10 μL 檢測，記錄HPLC 圖.以5 號峰苯甲酰新烏頭原堿（S）為對照峰，通過計算得到18 個三烏膠丸共有特征峰的相對保留時間的RSD<1.09%，18 個三烏膠丸共有特征峰的相對峰面積的RSD<2.80%，實驗結(jié)果表明，在24 h 內(nèi)，三烏膠丸樣品溶液穩(wěn)定.

2.4 三烏膠丸指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜建立及相似度評價 按本文的色譜條件制備三烏膠丸樣品溶液，進樣15 批次三烏膠丸的供試品溶液10 μL(S1～S15)，記錄HPLC圖.對15 個批次的三烏膠丸樣品色譜數(shù)據(jù)采取中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件進行匹配，以S4號三烏膠丸樣品色譜圖為參照，采取全譜匹配一共標(biāo)定18 個三烏膠丸共有特征色譜峰，生成如圖1所示的三烏膠丸共有模式R.經(jīng)軟件分析計算15批樣品相對于對照指紋圖譜R 的相似度分別為0.944、0.978、0.952、0.936、0.967、0.951、0.947、0.935、0.988、0.958、0.980、0.962、0.987、0.978、0.952，均大于0.9，說明各樣品之間具有良好的一致性，指紋圖譜疊加圖譜及共有模式見圖1.

圖1 15 批三烏膠丸 HPLC 指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）Fig.1 HPLC fingerprints and reference fingerprint(R)of 15 batches of Sanwujiaowan

2.4.2 色譜峰的指認(rèn)、歸屬 取混合對照品溶液、供試品溶液及單味藥溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行依次進樣，色譜如圖2 所示.通過與混合對照品進行對比，指認(rèn)出其中的6 個共有色譜峰，分別為：5 號峰苯甲酰烏頭原堿，6 號峰苯甲酰新烏頭原堿，7 號峰苯甲酰次烏頭原堿，8 號峰8?去乙酰滇烏堿，11 號峰為草烏甲素，12 號峰大黃素；將各單味藥材色譜圖與三烏膠丸樣品色譜圖比對分析（圖3）得：峰4、8、9、11、14 來自黃草烏，峰5、6、7、14 來自于川烏，峰12、13 來源于何首烏，峰16、17、18 來源于乳香，峰5、6、7、14 來源于黑順片.

圖2 混合對照品、三烏膠丸樣品色譜圖Fig.2 HPLC diagram of mixed reference substance and Sanwjiaowan sample

圖3 三烏膠丸樣品和單味藥色譜圖Fig.3 HPLC diagram of single herbs and Sanwujiaowan sample

2.5 三烏膠丸中6 種成分的含量測定

2.5.1 專屬性分析 分別精密吸取混合對照品溶液、三烏膠丸陰性對照品溶液10 μL，按“2.1”項下的色譜條件分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖4.由圖4可知，陰性樣品色譜在與對照品相應(yīng)保留時間位置上無色譜峰，表明對測定無干擾，方法專屬性良好.

圖4 混合對照品、三烏膠丸樣品及陰性樣品的HPLC 圖Fig.4 HPLC diagram of mixed reference substance,Sanwujiaowan sample and negative sample

2.5.2 線性關(guān)系的考察 精密吸取用酸性甲醇稀釋至2 倍、4 倍、20 倍、100 倍、200 倍的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，按本研究三烏膠丸指紋圖譜的色譜條件檢測草烏甲素等6 個待測化合物的峰面積.以混合標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，6 個待測化合物的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，計算各個化合物的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，求得6 個待測化合物的回歸方程及線性范圍.以信噪比S/N的3 倍作為檢出限，S/N的10 倍作為定量限，如表1 所示.

表1 6 個成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.1 The regression equation，correlation coefficients and linear ranges of 6 components

2.5.3 精密度試驗 按本文的色譜條件6 次不間斷進樣10 μL 上述制得的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，檢測保留時間及峰面積.計算得到6 個待測化合物的峰面積的RSD<2.95%，保留時間的RSD<0.08%，表明本文方法精密度良好.

2.5.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同一個批次的三烏膠丸1.0 g（批號：200903），按照本文所述的方法制作相同的6 份三烏膠丸供試品溶液，取上述6 份三烏膠丸樣品溶液連續(xù)進樣10 μL，記錄三烏膠丸中6 個待測化合物的保留時間和峰面積.計算得到6 個待測化合物的峰面積的RSD<3.05%，保留時間的RSD<0.24%，表明本文所述的方法的重復(fù)性良好.

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 按本研究的三烏膠丸的液相條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h 依次進樣10 μL 上述制得的三烏膠丸樣品溶液（批號：200903），測得保留時間，測定峰面積.6 個化合物的峰面積RSD 分別為大黃素1.01%，苯甲酰次烏頭原堿1.23%，8?去乙酰滇烏堿2.22%，苯甲酰烏頭原堿1.79%，草烏甲素0.57%，苯甲酰新烏頭原堿2.37%，實驗結(jié)果表明，在24 h 內(nèi)，三烏膠丸樣品溶液穩(wěn)定.

2.5.6 加樣回收率 精密稱定6 份已知含量的三烏膠丸（批號：200903），每份1.0 g，分別置具塞錐型瓶中，每份依次精確加入含量相當(dāng)?shù)拇簏S素、苯甲酰烏頭原堿、8?去乙酰滇烏堿、苯甲酰次烏頭原堿、草烏甲素、苯甲酰新烏頭原堿的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.按本文所述得色譜條件制備樣品溶液，依次進樣依次進樣10 μL 三烏膠丸樣品溶液，計算6 個待測成分的平均加樣回收率，結(jié)果草烏甲素、苯甲酰烏頭原堿、8?去乙酰滇烏堿、苯甲酰次烏頭原堿、大黃素、苯甲酰新烏頭原堿平均加樣回收率依次為100.3%，98.7%，100.2%，99.2%，98.4%，100.2%，RSD 依次為2.35%，1.97%，1.60%，2.06%，1.66%，1.19%.

2.5.7 QAMS 質(zhì)量評價模式相對校正因子的測定 取上述2.2.1 項下6 個待測成分的不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按上述色譜條件記錄各成分的峰面積，以苯甲酰新烏頭原堿（BMA）為內(nèi)參物，采用斜率法和多點校正法計算6 個待測成分間的相對校正因子（RCF）.兩種方法的結(jié)果見表2，相對誤差（RE）<3.0 %，表明上述2 種計算相對校正因子的方法無明顯差異，本研究采取斜率法用于三烏膠丸一測多評法的含量.

表2 6 個待測成分的相對校正因子Tab.2 The relative correction factors（RCF）of 6 components to be tested

2.5.8 6 個待測成分色譜峰的定位參數(shù)測定及重復(fù)性考察 通過公式 RTRi/s=tRi/tRs，計算5 個待測成分與內(nèi)參物苯甲酰新烏頭原堿（BMA）間的相對保留值（RTRi/s），其中tRi為待測成分保留時間，tRs為內(nèi)參物保留時間，結(jié)果見表3.

表3 6 個待測成分的相對保留時間值（n =6）Tab.3 Relative retention values of six components to be tested（n =6）

2.5.9 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較（表4）取15 批三烏膠丸樣品，再按本研究的色譜條件依次進樣10 μL 三烏膠丸供試品溶液，將6 個待測化合物的峰面積代入表2 的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算6 個化合物的含量（外標(biāo)法）.采取斜率法計算的相對校正因子，計算QAMS 中三烏膠丸中6 個待測成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

表4 ESM 與QAMS 測定三烏膠丸中待測成分的質(zhì)量比（μg·g?1，n =3）Tab.4 Contents of Sanwujiaowan by external standard method(ESM)and quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS)method(μg·g?1,n =3)

2.6 化學(xué)計量分析方法參考文獻[10-12].

2.6.1 CA 聚類分析 以15 批三烏膠丸樣品的6 個待測化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為變量，運用SPSS 23.0軟件進行CA 聚類分析，如圖5 所示.當(dāng)聚類距離為15 時，15 批三烏膠丸樣品可分為2 類，其中S1～S4 號樣品被聚為一類，S5～S15 號樣品被聚為一類，表明各批次的三烏膠丸具有一定的差異性.經(jīng)過對比批號與查閱生產(chǎn)日期發(fā)現(xiàn)，聚類分析結(jié)果表明，三烏膠丸呈現(xiàn)按照生產(chǎn)年限進行分類，推測可能是原料藥的產(chǎn)地及加工過程中有一定的差異性所造成的.

圖5 15 批三烏膠丸樣品聚類分析圖Fig.5 Clustering analysis of 15 batches of Sanwujiaowan prescription

2.6.2 PCA 主成分分析 將15 批三烏膠丸樣品的6 個待測化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)運用SPSS 23.0 軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理后進行PCA 主成分分析，三烏膠丸HPLC 指紋圖譜PCA 的特征值、方差貢獻率詳見表5.取三烏膠丸中特征值大于0.99 的前2 個主成分，其累計貢獻率達71.535%>70%，可作為三烏膠丸的評價指標(biāo).將得到的成分矩陣進行最大方差法旋轉(zhuǎn)，得到6 個指標(biāo)在2 個主成分中的旋轉(zhuǎn)矩陣，見表6.以6 個待測化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后為變量，進行向量運算，計算PCA 得分.取上述向量運算結(jié)果，繪制主成分得分圖，見圖6.結(jié)果顯示，15 批的三烏膠丸的樣品被分為2 類，其中S1～S4號樣品聚為第一類，S5～S15 號樣品被聚為第二類，與聚類分析結(jié)果完全一致.

圖6 15 批三烏膠丸樣品主成分分析得分圖Fig.6 Loading plot of 15 batches of Sanwujiaowan prescription

表5 主成分分析特征值及方差貢獻率Tab.5 The principal component value and contribution rate

表6 三烏膠丸樣品主成分因子旋轉(zhuǎn)載荷矩陣Tab.6 Factor load matrix after rotation transform of Sanwujiaowan

2.6.3 OPLS-DA 偏最小二乘判別分析 以15 批三烏膠丸6 個待測化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為變量導(dǎo)入SIMCA 14.0 軟件，進行OPLS-DA 建模分析，獲得相應(yīng)的模型，見圖7.15 批三烏膠丸樣品被分為2 類，與主成分分析和聚類結(jié)果一致.采用變量重要性投影（VIP）法篩選導(dǎo)致樣品分類差異較大的標(biāo)志性成分，以VIP>1.0 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出對三烏膠丸樣品分類貢獻較大的3 個成分，依次為5 號色譜峰（苯甲酰新烏頭原堿）、8 號色譜峰（8?去乙酰滇烏堿）、11 號色譜峰（草烏甲素），以上3 種物質(zhì)來自于黃草烏、川烏及黑順片中，導(dǎo)致了不同批次三烏膠丸含量及成分上的差異.

圖7 15 批三烏膠丸樣品的偏最小二乘判別分析得分圖Fig.7 PLS-DA score scatter plot of 15 batches of Sanwu jiaowan

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化本文在研究前期對流動相體系進行了考察，考察了乙腈?四氫呋喃（體積比25∶15）（B）?0.1 mol/L 乙酸銨溶液（每1 000 mL 加冰醋酸0.5 mL）（A），乙腈（B）?0.1%的磷酸水溶液（A），甲醇（B）?0.1%的磷酸溶液（A），乙腈（B）?0.1%二乙胺溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH=4.0）（A），乙腈（B）?0.2%二乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH=4.0）（A），乙腈（B）?0.1%三乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0）（A），對比各色譜峰的峰型、基線的平穩(wěn)、分離度及拖尾等情況，最終選擇乙腈?0.2%二乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH=4.0）體系.

三烏膠丸中主要活性成分是烏頭類的生物堿，其中黃草烏的主要成分是滇烏堿、草烏甲素等[13-14]，其最佳檢測波長是260 nm，而川烏的主要活性成分為烏頭堿等二萜生物堿，其檢測波長是235 nm[15-17]，何首烏中大黃素類的檢測波長為254 nm[18].故本研究對檢測波長進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其在245 nm 處各峰的分離度很好，峰型最佳，故選擇波長245 nm 為本文的檢測波長.

本研究對流動相梯度進行了優(yōu)化，在試驗了各個梯度后，最終選擇“2.1”項下的梯度，其峰型較佳，各個峰之間的分離良好，基線較為平穩(wěn).

3.2 提取溶劑和提取時間的考察本文前期考察了甲醇、乙醇、異丙醇?乙酸乙酯、乙醚提取對試驗結(jié)果的影響，最終選擇了乙醚提取法[19].對提取時間也進行了考察，考察了20、30、40、60 min 時對提取效率的影響.選擇提取時間為60 min，提取方式為低溫超聲提取.

3.3 測定成分的選擇三烏膠丸的方劑組方遵循了“君、臣、佐、使”的配伍原則，生草烏、生川烏為君藥，附子（黑順片）為臣藥，何首烏為佐藥，冰糖、豬蹄為使藥.生黃草烏、生川烏分別主要含有滇烏堿、烏頭堿等雙酯型烏頭堿，經(jīng)過三烏膠丸的處方工藝進行蒸煮后，主要轉(zhuǎn)換成8?去乙酰滇烏堿、苯甲酰烏頭原堿等單酯型毒性較小的二萜生物堿.本研究根據(jù)三烏膠丸的處方組成及各味藥材的主要功效，考察了君藥黃草烏的指標(biāo)性成分：8?去乙酰滇烏堿、草烏甲素；川烏的指標(biāo)性成分：苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿[20]；佐藥何首烏的指標(biāo)性成分：大黃素的含量.

3.4 三烏膠丸含量測定結(jié)果分析本文建立了三烏膠丸的指紋圖譜，對15 個批次的三烏膠丸的指紋圖譜進行相似度評價，結(jié)果表明其相似度均在0.9 以上，一共確定了18 個共有峰.以15 批次三烏膠丸的6 個待測成分的含量進行CA、PCA 和OPLS-DA 化學(xué)計量分析，均將15 批次的三烏膠丸分為2 類，3 種分析方法結(jié)果保持一致.OPLS-DA分析結(jié)果表明（圖7）苯甲酰新烏頭原堿、8?去乙酰滇烏堿、草烏甲素含量是導(dǎo)致不同批次三烏膠丸差異的主要成分.以上分析結(jié)果均表明S1～S4 號樣品被聚為第一類，生產(chǎn)于2019 年，S5～S15 號樣品被聚為第二類，生產(chǎn)于2020 年.表明引起三烏膠丸質(zhì)量差異的原因可能與原藥材的產(chǎn)地、三烏膠丸成品存放的時間與方式、生產(chǎn)月份的溫度、空氣濕度、天氣情況等都息息相關(guān).本文所建立的方法能較為準(zhǔn)確、科學(xué)、全面地反映三烏膠丸中的化學(xué)成分，不僅為三烏膠丸的質(zhì)量研究提供參考，還可為含有烏頭堿類相似成分如小活絡(luò)丸、木瓜丸、芪藶強心膠囊等質(zhì)量研究提供參考.