張新明，張玉紅，劉 明

（湖北三峽職業(yè)技術學院，湖北宜昌 443000）

黃鱔是我國淡水養(yǎng)殖中的重要水產(chǎn)動物，具有豐富的營養(yǎng)成分和經(jīng)濟價值。隨著黃鱔需求量不斷加大，導致黃鱔養(yǎng)殖密度增加，抗生素廣泛使用，造成黃鱔養(yǎng)殖環(huán)境發(fā)生變化，使黃鱔幼苗頻頻發(fā)病，頻繁病害給黃鱔養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重影響黃鱔養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（譚鳳霞等，2020）。黃鱔發(fā)病期間頻繁消毒和用藥給水體環(huán)境帶來巨大的危害，黃鱔機體會對藥物產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留。因此，找到一種穩(wěn)定、抗病力強、環(huán)保、高效的飼料添加劑替代抗生素十分必要。而益生菌是一類保持動物體內(nèi)微生物種類平衡，顯著提高動物生長速率，增強動物免疫機能的微生態(tài)制劑。益生菌對動物沒有毒副作用，具有提高動物生長速率，改善動物腸道菌群，促進動物對飼料的消化吸收，提高機體免疫功效等特點，已成為替代抗生素的微生態(tài)制劑（楊明容等，2017；粟雄高等，2012）。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一類益生菌，能抵御高溫環(huán)境，抗酸堿腐蝕和穩(wěn)定生物活性?？莶菅挎邨U菌在動物腸道內(nèi)消耗內(nèi)部氧氣，并產(chǎn)生酸性物質(zhì)，營造一種厭氧酸性環(huán)境，具有改善益生菌生存環(huán)境，降低有害菌濃度，保持腸道菌群穩(wěn)定，增加腸絨毛面積，促進腸道多種消化酶的分泌，維持各類消化酶活性，提高動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用效率，有利于動物增重，增強動物免疫機能（沈斌乾等，2013）?？莶菅挎邨U菌作為飼料添加劑已被廣泛用于水產(chǎn)動物飼料，許玉潔等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，將枯草芽孢桿菌添加到對蝦飼料中，會提高對蝦生長發(fā)育速率，維持腸道菌群穩(wěn)定，有利于對蝦對飼料的消化、吸收，提高對蝦免疫功效。目前，黃鱔的研究主要集中在生長發(fā)育、疾病防治等方面，而枯草芽孢桿菌作為黃鱔飼料添加劑的應用比較少。本文中探究不同添加水平枯草芽孢桿菌對黃鱔的腸道菌群和免疫功能的影響，分析和確定黃鱔飼料中枯草芽孢桿菌的最佳添加量，為黃鱔飼料配方中枯草芽孢菌的添加量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 黃鱔、枯草芽孢桿菌、飼料原料（高豆、魚粉、豆粕和玉米蛋白粉等物質(zhì)）購買于通威飼料有限公司。

1.2 枯草芽孢桿菌的提取 本試驗利用硫酸銨沉淀法來獲取枯草芽孢桿菌菌體蛋白，放入無菌燒杯內(nèi)，加入PBS溶解菌體蛋白，過濾后即可加入飼料中。

1.3 飼料配方 試驗設計如表1所示，試驗飼料成分如表2所示，黃鱔飼料配方中枯草芽孢桿菌的添加水平為0.25%，0.5%，0.75%，1%和1.25%，對照組黃鱔飼料以玉米蛋白粉為蛋白源，沒有添加枯草芽孢桿菌。稱取所有飼料原料后測定其營養(yǎng)含量，粉碎，并加入水混合，制成2 mm的顆粒料，放入烘干箱干燥處理，放入4℃冰箱備用。

表1 試驗設計

表2 飼料中枯草芽孢桿菌的配方原料

1.4 飼養(yǎng)管理要點 試驗黃鱔育苗來自教學養(yǎng)殖基地，養(yǎng)殖試驗在試驗基地網(wǎng)箱中進行，黃鱔按照規(guī)格（10.23±0.24）g進行分組，將飼養(yǎng)的黃鱔幼苗隨機分為6組，試驗組添加基礎飼料，對照組添加枯草芽孢桿菌，每組4個重復，每個重復36尾魚。正式飼養(yǎng)開始前對養(yǎng)殖基地的水塘進行消毒處理，黃鱔苗放入水箱內(nèi)暫養(yǎng)2周。飼養(yǎng)期間，黃鱔每天投喂適量的餌料，每天2次，根據(jù)天氣和水溫狀況及時調(diào)整餌料，觀察魚類攝食情況，及時記錄養(yǎng)殖情況，定時檢測養(yǎng)殖水質(zhì)，包括溶氧、氨氮、pH和水溫情況。飼養(yǎng)試驗期間每隔5 d換一次水，換水量為1/3，溶氧程度達到8～10 mg/L，養(yǎng)殖試驗為期8周。

1.5 樣品采集 飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，對黃鱔初體重和末體重進行測定，依據(jù)相應公式計算黃鱔生長發(fā)育的相關指標，具體公式如下：

餌料系數(shù)（FCR）=動物飼料中總投喂量/動物飼養(yǎng)期間增加的體重；

增重率（WGR，%）=（動物生長后總體重均值－動物生長前的體重均值）/動物生長前的體重均值×100；

特定生長率（SGR，%/d）=100×（ln動物生長后總體重－ln動物生長前的體重）/飼養(yǎng)試驗時間。

1.5.1 免疫指標測定 飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，將黃鱔禁食24 h，靜脈采血10 mL，放入相關試管內(nèi)，常溫離心后及時放入4℃冰箱保存。

采用相關試劑盒測定黃鱔血清的免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白（IgG）濃度，并檢測黃鱔促炎性因子IL-17，IL-6，TNF-a的含量，檢測方法參照試劑盒說明書。

1.5.2 腸道菌群指標測定 黃鱔飼養(yǎng)周期結(jié)束后，將試驗1～5組枯草芽孢桿菌組分別取出3條健康的黃鱔，取黃鱔腸道沉積物，放置于無菌EP管中，依據(jù)管越強等（2021）的方法測定黃鱔腸道菌群含量。

1.6 試驗數(shù)據(jù)分析 所有試驗數(shù)據(jù)均采用Excel表格記錄，采用SPSS 22.0軟件進行方差分析，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水平枯草芽孢桿菌對黃鱔生長相關指標的影響 由表3可知，隨著枯草芽孢桿菌添加水平的不斷提升，與對照組相比，試驗組黃鱔增重率先上升后下降；試驗1組和試驗5組黃鱔增重率分別為405.3%和439.3%，顯著高于對照組（P＜0.05）；在試驗3組中，黃鱔增重率達到最高（498.2%），顯著高于對照組（P＜0.05），試驗2組和試驗4組黃鱔增重率顯著高于對照組（P＜0.05）。隨著枯草芽孢桿菌添加水平不斷提升，黃鱔特定生長率先升后降，試驗3組黃鱔的特定生長率顯著升高，達到最高值（3.23%），顯著高于對照組（P＜0.05）；試驗2組和4組黃鱔的特定生長率顯著高于對照組（P＜0.05），而試驗1組和試驗5組黃鱔的特定生長率無明顯差異（P＞0.05）。隨著飼料枯草芽孢桿菌添加水平的升高，黃鱔飼料系數(shù)一直下降，試驗4組和試驗5組黃鱔的餌料系數(shù)明顯低于對照組（P＜0.05），試驗1～3組黃鱔的餌料系數(shù)明顯低于對照組（P＜0.05），高水平枯草芽孢桿菌飼料組可能會降低黃鱔餌料系數(shù)。

表3 不同水平枯草芽孢桿菌對黃鱔生長發(fā)育的影響

2.2 不同添加水平枯草芽孢桿菌飼料對黃鱔免疫相關指標的影響 由表4可知，隨著枯草芽孢桿菌添加水平的升高，試驗1～5組黃鱔血清IgM的濃度先升高后降低，試驗1組（0.25%）和試驗5組（1.25%）黃鱔血清中的IgM濃度明顯高于對照組（P＜0.05），試驗3組黃鱔血清IgM濃度顯著上升，并達到最高水平，為1.67ng/L，顯著高于對照組（P＜0.05），試驗1組和試驗3組黃鱔血清IgM濃度明顯高于對照組（P＜0.05）。試驗1～5組黃鱔血清IgA濃度隨飼料枯草芽孢桿菌的添加水平的升高先升高后降低。在試驗3組中，黃鱔血清中IgA濃度達到最高水平，為1.23ng/L，顯著高于對照組（P＜0.05），試驗5組中黃鱔血清IgA濃度與對照組無顯著差異，在試驗3組中黃鱔血清IgG的濃度最高，為3.54ng/L，明顯高于對照組（P＜0.05），試驗4組次之，顯著高于對照組（P＜0.05），試驗1組和5組黃鱔血清的IgG濃度顯著高于對照組（P＜0.05）。

表4 不同水平枯草芽孢桿菌飼料對黃鱔血清免疫球蛋白濃度的影響

不同添加水平枯草芽孢桿菌飼料與黃鱔炎性因子相關指標有密切聯(lián)系，由圖1～3可知，試驗3～5組中，黃鱔血清中IL-17濃度明顯下降，顯著低于對照組（P＜0.05），試驗1～2組中，黃鱔血清中IL-17濃度與對照組無明顯差異（P＞0.05）；試驗2～5組黃鱔血清TNF-α濃度明顯下降，顯著低于對照組（P＜0.05），試驗1組黃鱔血清TNF-α濃度與對照組無明顯差異（P＞0.05）；試驗2～5組中，黃鱔血清IL-6濃度不斷下降，顯著低于對照組（P＜0.05），試驗1組黃鱔IL-6含量與對照組無較大差異（P＞0.05）。

圖1 不同試驗組中黃鱔的IL-17含量

圖2 不同試驗組中黃鱔的TNF-a含量

圖3 不同試驗組中黃鱔的IL-6濃度

2.3 不同水平枯草芽孢桿菌對黃鱔腸道菌群相關指標的影響 由表5可知，不同添加水平的枯草芽孢桿菌對黃鱔鏈球菌屬無顯著影響（P＞0.05），隨著枯草芽孢桿菌添加水平不斷升高，黃鱔腸道中氣單胞菌屬和致病桿菌的含量先上升后下降，試驗3組氣單胞菌屬和致病桿菌屬的含量達到最高水平，其值分別是8.05 CFU/g和9.73CFU/g，顯著高于其他對照組（P＜0.05），其余各組黃鱔腸道中氣單胞菌屬和致病桿菌屬含量顯著高于對照組（P＜0.05）；隨著枯草芽孢桿菌添加水平的升高，黃鱔腸道中假單胞菌屬含量不斷上升，均顯著高于對照組（P＜0.05）；在試驗3組中，黃鱔腸道中芽孢桿菌屬的含量明顯高于對照組（P＜0.05），達到最高水平（10.04 CFU/g），顯著高于對照組（P＜0.05），其他試驗組中黃鱔腸道內(nèi)芽孢桿菌屬含量明顯高于對照組（P＜0.05）。

表5 不同添加水平的枯草芽孢桿菌飼料對黃鱔腸道菌群的影響 lg CFU/g

3 討論

隨著黃鱔集約化養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，提高黃鱔養(yǎng)殖密度可能會增加黃鱔苗種患病概率，而抗生素對動物機體會產(chǎn)生耐藥性，且藥物殘留量大，因此，枯草芽孢桿菌作為綠色益生菌可有效代替抗生素，成為一種環(huán)保、安全的綠色飼料添加劑。

3.1 不同水平枯草芽孢桿菌對黃鱔生長發(fā)育的影響 枯草芽孢桿菌是一種益生菌，被廣泛應用于水產(chǎn)動物飼料中?？莶菅挎邨U菌具有耐酸、耐高溫、穩(wěn)定性強等特點，能滿足動物體的營養(yǎng)需求，促進腸道分泌多種消化酶，擴大腸道絨毛結(jié)構(gòu)，提高動物對營養(yǎng)的消化吸收效率，改善腸道菌群的健康模式，有助于動物生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌添加水平為0.75%時將會顯著提高黃鱔增重率。本研究與孫盛明（2016）等在團頭魴（Megalobrama amblycephala）上的研究結(jié)果類似。許玉潔等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌是對蝦的飼料添加劑，當添加水平為0.5%時，對蝦特定生長率和增重率明顯上升，說明適量的枯草芽孢桿菌有助于對蝦的生長，但高水平的枯草芽孢桿菌將會降低對蝦增重率，使對蝦的生長發(fā)育受到限制。管越強等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，當添加劑枯草芽孢桿菌的添加量為1.0和0.5 g/kg可有效提高中華鱉的生長速率，當枯草芽孢桿菌添加量為4.1 g/kg時，中華鱉的特定增長率明顯低于對照組，增重率下降，結(jié)果表明，添加高水平枯草芽孢桿菌會抑制中華鱉的生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，高添加水平（1.25%）枯草芽孢桿菌組黃鱔生長發(fā)育速率顯著低于低添加水平（0.5%）組，產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因是黃鱔腸道一旦含有大量枯草芽孢桿菌，過多的枯草芽孢桿菌會打破腸道原有的菌群平衡，抑制腸道消化酶活性，降低腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率，從而使魚體缺乏足夠的營養(yǎng)，導致生長發(fā)育受到限制。

本研究發(fā)現(xiàn)，飼料枯草芽孢桿菌的添加水平為0.75%，對黃鱔生長發(fā)育有明顯影響；隨著黃鱔飼料枯草芽孢桿菌添加水平的不斷上升，黃鱔餌料系數(shù)不斷降低，表明飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌可顯著提高黃鱔腸道對飼料的消化吸收，其可能的原因是適量枯草芽孢桿菌被黃鱔腸道消化吸收后將會增加有益菌數(shù)量，維持腸道有益菌群平衡，同時刺激腸道分泌各類消化酶，維持消化酶活性，加速飼料分解過程，增強腸道絨毛面積，促進機體對飼料原料的吸收，使魚體的體重增加。

3.2 不同水平枯草芽孢桿菌對黃鱔免疫功能的影響 血清中免疫球蛋白含量可反映機體免疫功能的高低。IgA免疫球蛋白可有效抑制腸道黏膜處的細菌。IgG能激活機體內(nèi)的補體，抵御外來毒素作用。IgM在機體中可發(fā)揮重要作用，清除體內(nèi)病原體，防止外來病原的侵襲（許玉潔等，2015；沈斌乾等，2013；粟雄高等，2012）。本研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌添加水平0.75%時，黃鱔血清中IgG和IgM的濃度高于對照組，表明黃鱔飼料中適宜水平枯草芽孢桿菌可改善黃鱔免疫功效，增強機體免疫機能。IL-6、IL-17和TNF-a是促炎性因子，其濃度反應動物免疫功效。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料枯草芽孢桿菌添加水平不斷增加，黃鱔血清中IL-6，IL-17和TNF-a的濃度不斷下降，表明添加適量水平枯草芽孢桿菌會改善黃鱔的免疫功能。李浩等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適宜水平益生菌可能會提高豬的免疫力。這些研究結(jié)果表明，動物飼料中添加益生菌有助于提高動物機體免疫功效，其主要因素是枯草芽孢桿菌可能提高益生菌的生產(chǎn)能力，有助于有益菌的生長，保持腸道內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，維持腸道內(nèi)部健康，促進相關免疫菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，提高腸道免疫相關功效，從而提高動物機體免疫功效。

3.3 不同水平枯草芽孢桿菌對黃鱔腸道菌群的影響 試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適宜添加水平的枯草芽孢桿菌組黃鱔腸道內(nèi)芽孢桿菌屬的含量和假單胞菌屬的含量明顯升高，均高于對照組，結(jié)果表明，適宜添加水平枯草芽孢桿菌將會有效改善黃鱔腸道健康，維持黃鱔腸道結(jié)構(gòu)和菌群平衡。張獻月等（2013）研究表明，肉雞飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌將會顯著影響肉雞腸道形態(tài)，提高肉雞對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。雷玉杰等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加一定量的酵母物可有效改善斑馬魚的腸道健康，促進機體生長。因此，飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌有助于提高黃鱔健康發(fā)育，改善黃鱔免疫性能。

4 結(jié)論

在飼料中添加枯草芽孢桿菌會對黃鱔增重率和特定生長率產(chǎn)生促進作用，促進黃鱔幼苗的生長發(fā)育，有利于改善腸道健康狀況，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而有助于恢復黃鱔健康。在本試驗中，飼料添加0.75%的枯草芽孢桿菌效果最好，有利于黃鱔生長發(fā)育，增強黃鱔免疫功效。