李新淼 王圓圓 HESHUOTE Mailisi 白玉廷 包音都古榮·金花* 呼格吉勒圖 敖日格勒 薛 強(qiáng)

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；3.哥倫比亞大學(xué)，紐約 10027，美國；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；5.內(nèi)蒙古賀斯格綠色產(chǎn)業(yè)進(jìn)出口有限公司，錫林郭勒 026321)

西門塔爾牛因其優(yōu)秀的屠宰率、瘦肉率和肉用性能而成為我國主要的肉牛品種之一，其肉品質(zhì)和風(fēng)味研究受到許多學(xué)者的重視[1]。肌內(nèi)脂肪(IMF)含量和成分是判定牛肉大理石花紋、色澤、口感及嫩度等肉品質(zhì)的重要影響因素，而IMF中脂肪酸組成對其有很大影響[2-4]。特別是IMF中單不飽和脂肪酸(MUFA)含量，可降低脂肪熔點(diǎn)，使脂肪變得柔軟，有助于改善牛肉的風(fēng)味和嫩度[5]。IMF中脂肪酸的組成受多種因素調(diào)節(jié)，其中就包括遺傳因素。目前已證實(shí)許多基因可影響脂肪酸組成，如硬脂?；o酶A脫氫酶(SCD)[6]、脂肪酸合成酶(FASN)[7]、生長激素(GH)[8]、瘦素[9]基因等。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(sterol-regulatory element binding protein-1，SREBP-1)是一類轉(zhuǎn)錄因子，通過促進(jìn)糖酵解和脂肪生成，在能量平衡中發(fā)揮重要作用[10]。SREBP-1基因參與調(diào)控脂肪代謝和生長發(fā)育的代謝通路，其表達(dá)對于脂肪細(xì)胞分化和脂肪沉積至關(guān)重要[11]。通過對不同動物的不同組織研究發(fā)現(xiàn)，SREBP-1基因在不同動物中均有表達(dá)，且在不同組織中的相對表達(dá)量不同[12-14]。Hoashi等[15]對日本和牛SREBP-1基因第5內(nèi)含子84 bp插入缺失多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，SS基因型具有較高的MUFA含量和較低的脂肪熔點(diǎn)。本試驗(yàn)選用烏拉蓋高寒草原飼養(yǎng)的純種西門塔爾牛作為研究對象，通過測定血液中SREBP-1基因表達(dá)與脂肪酸組成和含量，分析SREBP-1基因表達(dá)及其不同基因型對脂肪酸組成和含量的影響，為今后西門塔爾牛繁育中優(yōu)良遺傳基因的保留提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)牛均為產(chǎn)自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋草原(年平均氣溫-0.9 ℃)的純種西門塔爾公牛，15月齡前在此草原上放牧飼養(yǎng)，自由運(yùn)動和采食，16～18月齡后于內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗育肥飼養(yǎng)。本試驗(yàn)從200頭牛群中隨機(jī)選取30頭牛，在04:00放牧前，使用含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的15 mL采血管從牛頸靜脈處采集血液，充分搖勻，取10 mL血液移至2個(gè)5 mL無菌無酶的凍存管中，標(biāo)記牛號，投入液氮中保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR及脂肪酸含量和組成的測定。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

采用TRIzol法提取血液中的總RNA，提取的總RNA經(jīng)微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和完整性，符合要求后，立即使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)進(jìn)行cDNA的合成。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的SREBP-1和β-肌動蛋白(β-actin)基因引物均參考付常振等[16]的引物序列。SREBP-1：5’-CAATGTGTGAGAAGGCCAGT-3’(正向引物)和5’-ACAAGGAGCAGGTCACACAG-3’(反向引物)；β-actin：5’-CCAACGTGTCTGTTGTGGAT-3’(正向引物)和5’-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’(反向引物)。目的基因和內(nèi)參基因引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以西門塔爾牛血液RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板，β-actin為內(nèi)參，利用LightCycler480實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增，預(yù)變性95 ℃ 30 s進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，PCR分析模式為定量分析95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，熔解分析模式為熔解曲線95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，降溫50 ℃ 30 s進(jìn)行1個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用相對定量的方法，使用2-△△Ct法計(jì)算西門塔爾牛血液中SREBP-1基因相對表達(dá)量。

1.4 全基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取血液全基因組DNA。提取的DNA經(jīng)微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和完整性，符合要求后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物參考Hoashi等[15]發(fā)表的SREBP-1基因引物序列，5’-CCACAACGCCATCGAGAAACGCTAC-3’(正向引物)和5’-GGCCTTCCCTGACCNCCCAACTTAG-3’(反向引物)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)在94 ℃變性5 min后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，包括94 ℃變性30 s，63.9 ℃變性30 s，72 ℃變性1 min，72 ℃變性7 min，4 ℃保存。

1.5 基因型檢測

SREBP-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多肽之間有84 bp的差距，由于該片段特殊的插入或缺失突變，不同基因型的PCR產(chǎn)物由于片段長度不同，電泳時(shí)分離速度不同，所以擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行分型，因此使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接點(diǎn)樣，120 V電泳30 min，在凝膠成像儀上觀察擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果分析基因型。選擇電泳條帶清晰明亮的樣品，純化后檢測成功的樣本采用BDT試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng)。依次加入測序酶、緩沖液、引物和純化后的產(chǎn)物，上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行純化。采用酒精純化法，純化后的產(chǎn)物加入高度去離子甲酰胺混勻，使用ABI 3730xl DNA Analyzer測序，比對測序結(jié)果驗(yàn)證是否存在84 bp的堿基差異。

1.6 脂肪酸組成和含量測定

參照簡路洋等[17]方法進(jìn)行血液樣品的前處理和脂肪酸的提取、皂化與酯化處理。使用美國Agilent公司產(chǎn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975C)及Supelco SPTM-2560氣相毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)分析脂肪酸組成和含量。在上述操作條件下，測定37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品，以對不同脂肪酸組成的保留時(shí)間進(jìn)行定性。采用面積歸一化法，通過測定相應(yīng)峰面積對所有成分峰面積總和的百分?jǐn)?shù)來計(jì)算每個(gè)脂肪酸的含量，用百分比表示。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行整理，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0對脂肪酸含量和基因相對表達(dá)量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析(one-way ANOVA)和皮爾遜(Pearson)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SREBP-1基因相對表達(dá)量和主要脂肪酸含量的顯著性分析

血液樣品中共測得36種脂肪酸，其中飽和脂肪酸(SFA)17種，MUFA 8種，多不飽和脂肪酸(PUFA)11種。高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SREBP-1基因相對表達(dá)量和主要脂肪酸含量的顯著性分析結(jié)果如表1所示，在高寒草原飼養(yǎng)的西門塔爾牛血液中SREBP-1基因相對表達(dá)量為0.20%；SFA和MUFA含量分別為38.65%和25.42%，MUFA/SFA為0.67。SFA中棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)含量較高，分別為12.57%和21.76%；MUFA中油酸(C18∶1)含量最高，為22.11%；PUFA中亞油酸(18∶2)含量最高，為29.53%。SREBP-1基因相對表達(dá)量對西門塔爾牛血液脂肪酸中的肉豆蔻酸(C14∶0)、肉豆蔻油酸(C14∶1)、C16∶0、C18∶2和SFA含量以及MUFA/SFA、C14指數(shù)、C16指數(shù)、C18指數(shù)和伸長指數(shù)有顯著性影響(P<0.05)。

表1 高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SREBP-1基因相對表達(dá)量和主要脂肪酸含量的顯著性分析Table 1 Significant analysis of blood SREBP-1 gene relative expression level and main fatty acid contents of Simmental cattle raised in alpine grassland

2.2 高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SREBP-1基因相對表達(dá)量與脂肪酸含量的相關(guān)性

對高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SREBP-1基因相對表達(dá)量與C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1和MUFA含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示，血液SREBP-1基因相對表達(dá)量與16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1和MUFA含量呈正相關(guān)，且均無顯著性(P>0.05)。

表2 高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液SREBP-1基因表達(dá)量與脂肪酸含量的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between blood SREBP-1 gene relative expression level and fatty acid content of Simmental cattle raised in alpine grassland

2.3 SREBP-1基因分型結(jié)果

SREBP-1基因第5內(nèi)含子區(qū)的84 bp插入或缺失，使得不同基因型的PCR產(chǎn)物之間有84 bp的長度差異，因此擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物可直接通過凝膠電泳根據(jù)片段分離距離判斷其基因型。如圖1和圖2所示，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)存在多態(tài)，分別定義為LL基因型(插入型)和LS基因型(雜合型)2種基因型；對LL和LS基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別純化進(jìn)行測序，結(jié)果進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，SREBP-1基因2條條帶確實(shí)存在84 bp的堿基差異。

LL：LL基因型 LL genotype；LS：LS基因型 LS genotype。圖1 SREBP-1基因分型結(jié)果Fig.1 Typing results of SREBP-1 gene

圖2 SREBP-1基因型測序比對結(jié)果Fig.2 Sequencing comparison results of SREBP-1 genotypes

2.4 SREBP-1不同基因型對高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液脂肪酸組成的影響

對高寒草原飼養(yǎng)的西門塔爾牛血液SREBP-1基因進(jìn)行分型，共得到2種基因型，分別為LL和LS基因型，其基因型頻率分別0.90和.010，L和S等位基因頻率分別為0.95和0.05。SREBP-1基因型對西門塔爾牛血液脂肪酸組成的影響如表3所示，C14∶0(0.74%)、C14∶1(0.17%)、C16∶0(15.91%)、C18∶0(23.56%)含量以及C14指數(shù)(0.12)均為LS基因型高，C16∶1(1.62%)、C18∶1(22.51%)、C18∶2(29.57%)、SFA(44.54%)和MUFA(25.84%)含量以及MUFA/SFA(0.69)、C16指數(shù)(0.12)、C18指數(shù)(0.51)和伸長指數(shù)(0.76)均為LL基因型高。上述脂肪酸組成在LL和LS基因型基因中均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 SREBP-1基因型對高寒草原飼養(yǎng)西門塔爾牛血液脂肪酸組成的影響Table 3 Effects of SREBP-1 genotype on blood fatty acid composition of Simmental cattle raised in alpine grassland

3 討 論

高寒草原飼養(yǎng)的西門塔爾公牛血液SREBP-1基因相對表達(dá)量為0.20%。Ohsaki等[18]研究發(fā)現(xiàn)SREBP-1基因?qū)诿团Ｖ舅嶂蠧14∶0、C16∶0、C14指數(shù)和伸長指數(shù)均有顯著性影響，此結(jié)果與本試驗(yàn)一致。同時(shí)本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)SREBP-1基因?qū)Ω吆菰曫B(yǎng)的西門塔爾牛血液中C14∶1、C18∶2和SFA含量以及MUFA/SFA、C16指數(shù)和C18指數(shù)也有顯著性影響。已知SREBP-1基因是SCD1基因的調(diào)控因子，SCD1主要作用于C16∶0和C18∶0，使其轉(zhuǎn)化為C16∶1和C18∶1，從而調(diào)控MUFA含量[19]。本試驗(yàn)中，血液SREBP-1基因相對表達(dá)量與C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1和MUFA含量均呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，SCD1基因相對表達(dá)量與C16∶1、C18∶1和MUFA含量有正效應(yīng)關(guān)系[20]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果可初步判斷SREBP-1基因和SCD1基因有著共同促進(jìn)MUFA合成的作用，但仍需后續(xù)研究證實(shí)。

基因多態(tài)性是影響脂肪酸組成的因素之一。本試驗(yàn)樣品中SREBP-1基因檢測僅到LL基因型和LS基因型2種基因型。Han等[21]檢測了225頭安格斯雜交牛的SREBP-1基因多態(tài)性，未得到SS基因型，與本文研究結(jié)果一致。高寒草原飼養(yǎng)的西門塔爾牛SREBP-1基因的L/S等位基因頻率在公牛血液中分別為0.950和0.050，在公牛背最長肌中分別為1.000和0.000，在母牛血液中分別為0.986和0.014，母牛背最長肌中分別為0.900和0.100。Hoashi等[15]和Matsuhashi等[22]統(tǒng)計(jì)分析了日本黑牛不同群體中第5內(nèi)含子長度多態(tài)的基因頻率，L/S等位基因頻率分別為0.632、0.368和0.49、0.51，在韓國漢宇牛中L/S等位基因頻率分別為0.72和0.28[23]。在Fleckvieh牛群體中，觀察到L/S等位基因頻率為0.920 3和0.079 7[24]。以上研究均具有較低的S等位基因頻率，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，是牛群體中SREBP-1基因多態(tài)性的普遍結(jié)果。

SREBP-1基因參與調(diào)控脂肪代謝，其對脂肪酸組成也有一定影響。Hoashi等[15]研究日本和牛發(fā)現(xiàn)，SS基因型具有更高的MUFA含量。Bhuiyan等[23]報(bào)道，LL基因型的韓國漢宇牛的硬脂酸含量分別比LS和SS基因型高5.7%和6.3%。Barton等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與皮下脂肪中的LL基因型相比，LS基因型的肉豆蔻油酸含量更高。在韓國牛中，LL基因型有較高的硬脂酸含量和較低的亞油酸含量[23]。然而，Matsuhashi等[22]報(bào)告，SREBP-1基因多態(tài)性對日本黑牛群體的脂肪組織和胸最長肌中的脂肪酸組成沒有影響。本試驗(yàn)研究得出高寒草原飼養(yǎng)的西門塔爾牛血液中SREBP-1基因的LL和LS基因型對脂肪酸組成均無顯著性影響，與Matsuhashi等[22]研究結(jié)果一致。SREBP-1基因多態(tài)性與不同肉牛群體脂肪酸的相關(guān)性不一致，SREBP-1基因?qū)θ馀Ｖ舅峤M成的影響尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 高寒草原飼養(yǎng)的純種西門塔爾牛血液中含有豐富的脂肪酸組成，血液SREBP-1基因?qū)14∶0、C14∶1、C16∶0、C18∶2和SFA含量以及MUFA/SFA、C14指數(shù)、C16指數(shù)、C18指數(shù)和伸長指數(shù)均有顯著性差異。

② 血液SREBP-1基因相對表達(dá)量與C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1和MUFA含量均呈正相關(guān)關(guān)系。

③ 血液SREBP-1基因在第5內(nèi)含子84 bp處有插入缺失多態(tài)性，表現(xiàn)為LL和LS基因型，2種基因型之間脂肪酸組成均無顯著性差異。

④SREBP-1基因可以作為高寒草原飼養(yǎng)下西門塔爾牛品種培育和評估的重要候選基因。